灯盏生脉胶囊抗大鼠局灶性.pdf

灯盏生脉胶囊抗大鼠局灶性 脑缺血 2 再灌注损伤作用研究 李 浩 贾建平 首都医科大学宣武医院神经内科 北京 100053 摘 要 目的 研究灯盏生脉胶囊抗大鼠局灶性脑缺血 2 再灌注损伤的作用 方法 将58只雄性SD大鼠随机 分为4组 即假手术组10只 0 9 氯化钠溶液组和灯盏生脉胶囊高 低剂量组各16只 假手术组行假手术 其他3组制 作大脑中动脉缺血 2 再灌注模型 假手术组和0 9 氯化钠溶液组于术前72 48 24 0 5 h及术后22 h灌胃给予0 9 氯 化钠溶液 灯盏生脉胶囊低 高剂量组在相同时点分别按0 36和0 72 g kg2 1剂量灌胃给予灯盏生脉胶囊内容物悬浊液 4 mL 各组大鼠均在最后一次给药后2 h处死 于脑缺血2 h和再灌注2和22 h分别进行神经行为学评分 再灌注22 h 后测定大鼠血清乳酸脱氢酶活性及脑梗死体积百分比 观察脑组织病理学改变 结果 再灌注2 h后 灯盏生脉胶囊高 剂量组神经行为学评分 1 75 0 68 分 较0 9 氯化钠溶液组 2 31 0 79 分 明显降低 P 0 05 再灌注22 h 后 灯盏生脉胶囊高剂量组神经行为学评分 1 63 0 89 分 明显低于0 9 氯化钠溶液组 2 38 1 09 分 P 0 05 再灌注22 h后 灯盏生脉胶囊高剂量组血清乳酸脱氢酶活性 1 331 89 366 85 U L2 1 明显低于0 9 氯化 钠溶液组 1 799 56 325 92 U L 1 P 0 05 灯盏生脉胶囊高剂量组脑梗死体积百分比 9 73 5 66 亦明 显低于0 9 氯化钠溶液组 18 31 6 96 P 0 05 灯盏生脉胶囊低 高剂量组鼠脑组织缺血周围区细胞周围 水肿 神经元变性和间质破坏较其他各组轻 结论 灯盏生脉胶囊有一定的抗大鼠局灶性脑缺血 2 再灌注损伤作用 作 用机制可能在于抑制缺血半暗带恶化 高剂量作用更明显 关键词 灯盏生脉胶囊 脑缺血 2 再灌注损伤 中图分类号 R286 文献标识码 A 文章编号 100420781 2007 0820846205 Effect ofD engzhan Shengm aiCapsules on Focal Cerebral Ischem ia reperfusion Injury in Rats L IHao J I A Jian2ping Departm ent of N eurology Xuanwu Hospital of Capital University of M edical Sciences B eijing100053 China ABSTRACT Objective To study the effect of dengzhan shengmai capsules on the focal2reperfusion injury in rats M ethods 58 male Sprague2Dawley ratswere randomly divided into 4 groups sham operation group 10 physiological saline group 16 group of low2dosage 16 and group of high2dosage of dengzhan shengmai 16 Sham operation was performed in sham operation group and middle cerebral artery ischemia2reperfusion model was established in the other 3 groups 4 mL of 0 9 sodium chloride 0 36 and 0 72 g kg2 1 of suspension of dengzhan shengmai capsuleswere given by intra gavage at 72 48 24 0 5 h before operation and 22 h after operation in sham operation physiological saline low dose and high dose group respectively Ratswere sacrificed 2 h after the last drug administration neurological behavior evaluation was done for rats at different time 2 h after cerebral ischemia and 2 h 22 h after reperfusion Lactate dehydrogenase LDH activity in serum the percentage of cerebral infarct size and neuropathologic histopathological changeswere observed 22 h after reperfused Results 2 hours after reperfusion nerve deficit scores in high2dosage group for dengzhan shengmai 1 75 0 68 was significantly decreased comparingwith physiological saline group 2 31 0 79 P 0 05 22 hours after reperfusion nerve deficit scores in high2dosage group 1 63 0 89 was significantly decreased as well comparing with physiological saline group 2 38 1 09 P 0 05 22 hours after reperfusion LDH activity in serum of high2dosage group 1331 89 366 85 U L2 1 was also significantly decreased comparingwith physiological saline group 1799 56 325 92 U L2 1 P 0 05 and the cerebral infarct size in high2dosage group 9 73 5 66 was significantly decreased too comparing with physiological saline group 18 31 6 96 P 0 05 Neuropathologic changes like cell edema around cerebral ischemic areas neuronal degeneration and interstitial damages in both low2dosage group and high2dosage group all were alleviated compared with other groups Conclusion Dengzhan shengmai capsules could protect focal cerebral ischemia2reperfusion injury the mechanism ofwhich might be due to inhibit the farther deterioration of ischemic penumbra The high2dosage showed more obvious effect KEY WORDS Dengzhan Shengmai capsule Cerebral ischemia Reperfusion injury Note Thedengzhan shengmaicapsule was composed of Ginseng dengzhanxixin and liriope 目前公认溶栓治疗是缺血性脑血管病最有效的治疗方法之一 我国常用的溶栓药物是尿激酶 但由于 648 Herald ofMedicine Vol126 No18 August 2007 其较短的治疗时间范围与合并出血等问题 限制了其 常规应用 中药是我国传统医学的瑰宝 具有很大的 发展潜力 近年来人们从灯盏花中成功提炼出灯盏细 辛 发现对缺血性脑血管病有较好的疗效 灯盏生脉 胶囊以灯盏细辛为主要成分 配以人参 五味子及麦 冬 具有益气养阴 活血健脑等功能 主治气阴两虚 瘀 阻脑络引起的卒中后遗症等 本实验则以其为研究对 象 采用动物实验方法评价灌胃给予该药物是否对大 鼠大脑中动脉脑缺血 2 再灌注损伤具有保护作用 1 材料与方法 1 1 仪器与试药 AR1140电子天平 PYX2DHS隔 水式电热恒温干燥箱 HWS220恒温水浴箱 尼康数码 相机 微量移液器 国产尼龙钓鱼线 直径0 26 mm 普通生化管 购自北京伊瑞得生物科技有限公司 日 立7170全自动生化分析仪 灯盏生脉胶囊 云南生物谷灯盏花药业有限公司 提供 批准文号 国药准字20026439 含灯盏细辛 人 参 五味子 麦冬 每180 mg胶囊颗粒中含灯盏细辛野 黄芩苷不少于15 mg 红四氮唑粉末 分析纯 购自美 国Promega公司 氯化钠粉末 多聚甲醛粉末均为分 析纯 购自北京市法杰德化工试剂公司 10 水合氯 醛 宣武医院药剂科提供 1 2 实验动物与分组 健康雄性SD大鼠58只 3 4 个月龄 体重250 300 g 由北京维通利华实验动物技 术有限公司提供 动物质量合格证号 SCXK 京 20022 003 将大鼠随机分为以下4组 即假手术组10只 0 9 氯化钠溶液组 仅给予0 9 氯化钠溶液4 mL 灯盏生脉低剂量组 0 36 g kg 21 将灯盏生脉胶囊颗 粒溶于0 9 氯化钠溶液4 mL中制成 和灯盏生脉高 剂量组 0 72 g kg 21 将灯盏生脉胶囊颗粒溶于0 9 氯化钠溶液4 mL中制成 各16只 1 3 实验方法 1 3 1 大鼠大脑中动脉脑缺血 2 再灌注模型的建立 0 9 氯化钠溶液组 灯盏生脉低剂量组与高剂量组采 用改良线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞 middle cerebr2al artery occlusion MCAO 模型 即从左侧颈总 动脉近分叉处放入栓线 栓线为4号尼龙钓鱼线 头 收稿日期 2007203210 修回日期 2007204209 作者简介 李 浩 1981 男 四川人 在读硕士 研 究方向 缺血性脑血管病 电话 0E2mail lihao 1981 163 com 通讯作者 贾建平 1954 男 河北人 博士 教授 研究方向 缺血性脑血管病 电话 0E2mail jiaxuanwu 126 com 端3 4 mm用704硅胶处理成直径0 28 0 32 mm 的水滴状 当其头端进入动脉内约18 5 mm即可阻 断左侧大脑中动脉血流 同时结扎颈外动脉和颈总动 脉近心端 栓塞2 h后将栓线拔出约2 cm实现再灌 注 假手术组仅分离颈部动脉 不作其他处理 以 Longa5分法 1 作为判断模型成功的标准 0分 无神经 缺损症状 1分 提尾时瘫侧前肢内收 不能完全伸直 2分 行走时向瘫侧倾倒 3分 行走时向瘫侧旋转 4 分 不能行走或昏迷 1 4分为有效模型 可纳入研 究 1 3 2 给药方法 灯盏生脉低 高剂量组于术前72 48 24和0 5 h及术后22 h灌胃给予相应的灯盏生脉 胶囊内容物悬浊液4 mL 0 9 氯化钠溶液组与假手 术组在相同的时间点各灌胃给予0 9 氯化钠溶液4 mL 各组大鼠均在最后一次给药后2 h处死 1 3 3 神经行为学评分 依照ZEA LONGA的5分 法 1 评分标准 在再灌注的2与22 h分别对各组大鼠 进行神经行为学评分 1 3 4 血清乳酸脱氢酶的测定 每组取9只大鼠 处 死前采用2 5 mL注射器在大鼠心脏搏动的最强点进 针 抽取血液1 mL 待血清析出后 在4 下离心 3 000 r min 21 15 min 分离的血清 20 保存 样品集全后由宣武医院检验科采用日立7170全自动 生化分析仪测定血清乳酸脱氢酶活性 1 3 5 梗死体积百分比与脑含水量的测定 假手术 组取大鼠2只 0 9 氯化钠溶液组 灯盏生脉低 高剂 量组各取7只大鼠麻醉后开胸 从升主动脉处灌注 4 0 9 氯化钠溶液 待肝脏褪色后开颅取脑 将脑 组织放于 20 冷冻1 h后除去小脑 嗅球和低位脑 干 用刀片将大脑切成厚度2 mm的脑片 称量得脑 湿重 脑片在2 红四氮唑溶液中37 避光水浴1 h 数码相机拍照 Photoshop软件处理照片 依据公式 2 V A1 A2 2 d mm 3 计算脑梗死体积百分比 A1 A2为脑片嘴 尾侧的梗死面积 d为脑片厚度 求 得脑梗死体积V 同法求得脑总体积V0 V V0即得到 梗死体积百分比 拍照后脑片放入烘箱中烘烤24 h 以上再次称量得到脑干重 脑含水量 脑湿 重 脑干重 脑湿重 100 1 3 6 组织病理学改变 假手术组取7只大鼠 0 9 氯化钠溶液组 灯盏生脉低 高剂量组各取8只 大鼠麻醉后开胸 经升主动脉灌注4 多聚甲醛溶液 pH 值 7 4 待大鼠四肢僵硬后开颅取脑 大脑放 于4 多聚甲醛溶液中保存 样品齐全后采用石蜡包 埋制片 苏木精 2 伊红染色 光镜下观察神经细胞 神 748 医药导报2007年8月第26卷第8期 经胶质细胞及间质的形态学改变 每组取1只大鼠麻醉后开胸 经升主动脉灌注 4 多聚甲醛溶液 pH 值7 2 7 4 待大鼠四肢僵 硬后开颅取脑 在大脑额顶区梗死组织与正常组织交 界处取6个直径1 mm的组织块制作电镜标本 2 多 聚甲醛 22 5 戊二醛中固定2 h 0 1 mol L 21磷酸盐 缓冲液 pH 值7 2 7 4 冲洗 1 四氧化锇固定2 h 0 1 mol L 21磷酸盐缓冲液冲洗 3次 梯度乙醇脱水 环氧树脂Epon812包埋 制备1 m半薄切片 甲苯胺 蓝染色定位 制备50 nm超薄切片行醋酸铀 2 枸橼酸铅 染色 用H2600型透射电子显微镜观察神经细胞 神经胶质细胞 血管内皮细胞及细胞中细胞器的形态 改变 1 4 统计学方法 使用SPSS 10 0 forW indows处理 实验数据 所有的计量资料用 均数 标准差 表示 首先对计量资料进行正态性检验 利用t检验对符合 者进行两组或多组间的比较 不符合者用秩和检验进 行分析 所有统计检验均为双侧概率检验 P 0 05 表示差异有显著性 2 结果 2 1 神经行为学评分 除假手术组外 其他各组都出 现神经行为缺陷 灯盏生脉低剂量组与0 9 氯化钠 溶液组再灌注2与22 h后的神经行为学评分均差异 无显著性 而灯盏生脉高剂量组再灌注2与22 h神 经行为学评分均明显低于0 9 氯化钠溶液组 均P 0 05 结果见表 1 表1 4组大鼠神经行为学评分结果 分 组 别例数再灌注2 h评分再灌注22 h评分 灯盏生脉高剂量组161 75 0 683 1 1 63 0 893 1 灯盏生脉低剂量组161 94 0 572 25 1 73 0 9 氯化钠溶液组162 31 0 792 38 1 09 假手术组100 00 0 000 00 0 00 与0 9 氯化钠溶液组比较 31 P 0 05 2 2 血清乳酸脱氢酶活性测定结果 假手术组与 0 9 氯化钠溶液组相比 乳酸脱氢酶显著降低 P 0 05 灯盏生脉低剂量组与0 9 氯化钠溶液组乳酸 脱氢酶水平差异无显著性 灯盏生脉高剂量组较0 9 氯化钠溶液组乳酸脱氢酶显著降低 P 0 05 结果 见表2 2 3 脑梗死体积百分比与脑含水量测定结果 假手 术组两侧大脑染色均为桔红色 无苍白色梗死灶 0 9 氯化钠溶液组 灯盏生脉低剂量组与高剂量组的 非手术侧染色基本为桔红色 手术侧有不同范围的苍 白色梗死灶 梗死累及范围主要为额顶叶的背外侧皮 质 尾壳核 下丘脑部分 严重时累及到海马区甚至一 侧大脑半球 表2 4组大鼠血清乳酸脱氢酶活性测定结果U L2 1 组 别例数血清乳酸脱氢酶活性 灯盏生脉高剂量组91 331 89 366 853 1 灯盏生脉低剂量组91 397 89 462 70 0 9 氯化钠溶液组91 799 56 325 92 假手术组91 294 11 516 713 1 与0 9 氯化钠溶液组比较 31 P 0 05 灯盏生脉低剂量组与0 9 氯化钠溶液组比较 梗死体积百分比差异无显著性 灯盏生脉高剂量组与 0 9 氯化钠溶液组比较 梗死体积百分比显著降低 P 0 05 灯盏生脉低剂量组和高剂量组脑含水量 与0 9 氯化钠溶液组差异无显著性 结果见表3 表3 3组大鼠脑梗死体积百分比与脑含水量测定结果 组别例数梗死体积百分比脑含水量 灯盏生脉高剂量组79 55 6 953 1 76 00 7 62 灯盏生脉低剂量组710 27 3 7580 01 3 50 氯化钠溶液组718 31 6 9682 05 1 07 与0 9 氯化钠溶液组比较 31 P 0 05 2 4 脑组织病理学变化 2 4 1 光镜观察苏木精 2 伊红染色的显微结构 假手 术组神经元形态正常 细胞核清晰可见 神经细胞与神 经胶质细胞周围存在狭窄间隙 间质染色均匀 0 9 氯化钠溶液组缺血中心区域内神经细胞大量消失 间 质呈空泡样改变甚至大片破坏 缺血周围区神经细胞 皱缩 周围间隙明显增大 间质染色稀疏 灯盏生脉低 剂量组缺血中心区域内神经细胞大量消失 间质部分 区域破坏 缺血周围区神经细胞胞核较清晰 周围间隙 轻度增大 间质染色稀疏不明显 灯盏生脉高剂量组 缺血中心区域神经细胞大量消失 间质部分区域空泡 样变 缺血周围区神经细胞核较清晰 周围间隙轻度增 大 间质染色减淡 各组病理切片见图1 2 4 2 电镜观察超微结构 假手术组神经细胞及细 胞器形态大致正常 部分线粒体嵴模糊不清 少数星形 胶质细胞可见其足突水肿 其中线粒体嵴模糊不清 血 管内皮细胞大致正常 0 9 氯化钠溶液组神经细胞电 子密度增高 胞质中多聚核糖体解聚 高尔基复合体囊 泡扩张 脂褐素大量存在 线粒体嵴基本消失 星形胶 质细胞足突严重水肿 未见细胞器 血管内皮细胞肿 胀 血管管腔狭窄 灯盏生脉低剂量组部分神经细胞电 子密度增高 线粒体轻度肿胀 部分嵴断裂 星形胶质 细胞足突轻度肿胀 可见肿胀的线粒体 血管内皮细胞 大致正常 灯盏生脉高剂量组大部分神经细胞形态正 848 Herald ofMedicine Vol126 No18 August 2007 常 胞质中可见正常细胞器 星形胶质细胞大致正常 可见细胞器 血管内皮细胞正常 结果见图2 图1 4组大鼠大脑缺血周围区苏木精 2 伊红染色 400 A 假手术组神经细胞形态基本正常 间质染色均匀 B 0 9 氯化钠溶液组缺血周围区神经细胞周围间隙明显增大 间质稀 疏 C 灯盏生脉低剂量组缺血周围区神经细胞周围间隙轻度增大 间质无明显稀疏 D 灯盏生脉高剂量组缺血周围区神经细胞形 态基本正常 部分周围间隙增宽 间质无明显稀疏 图2 4组大鼠大脑缺血周围区神经细胞透射电镜观察结果 A 假手术组正常神经细胞 8 000 B 0 9 氯化钠溶液组神经细胞电子密度增高 核固缩 胞浆内线粒体肿胀 嵴排列紊乱 12 500 C 灯盏生脉低剂量组神经细胞电子密度稍升高 核固缩 6 300 D 灯盏生脉高剂量组神经细胞电子密度稍升高 核染色质及细胞器正常 12 500 3 讨论 灯盏花的作用始载于 滇南本草 1977年版 中 华人民共和国药典 第一部中将其收录 3 目前研究 发现 从灯盏花中提取得到的灯盏细辛类药物可以提 高超氧化物歧化酶 过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物 酶活性 抑制脂质过氧化反应 减轻自由基对脑组织的 损害 从而对缺血 2 再灌注的脑组织起到保护作用 4 近年来该药广泛应用于缺血性脑卒中的治疗 取得了 较好的临床效果 研究发现 不同剂型的灯盏细辛药物存在明显的 药动学差异 其临床疗效也不同 5 近年来的研究多 集中在注射液方面 而对其口服剂型的研究尚少见 这 为笔者提供了研究的必要 灯盏生脉胶囊系新开发的 口服胶囊 灯盏细辛为其主要成分 本研究以其为研 究对象进行了大鼠实验观察 数据显示灯盏生脉胶囊 治疗组的血清乳酸脱氢酶活性 梗死体积百分比与 0 9 氯化钠溶液组相比显著降低 而神经行为学临床 症状得到改善 表明病变减轻 组织病理学观察发现灯盏生脉胶囊治疗组改善了 大鼠脑组织病理变化 减轻了细胞周围水肿 神经元变 性和间质破坏 病理学改善主要发生在缺血周围区 表明缺血周围区向缺血中心区转化的趋势得到抑制 从而可以减少梗死灶的体积与水肿程度 有利于预后 药物的作用机制主要是通过减轻再灌注损伤 挽救缺 血半暗带 6 7 虽然实验结果表明灯盏生脉高低剂量组之间并不 存在确切的剂量依赖关系 但是灯盏生脉胶囊高剂量 组对鼠脑组织病理的改善趋势要比低剂量组明显 表 明采用较大剂量可能取得更好的效果 这说明若采用 先进的加工工艺 口服给药也能取得与静脉给药相近 的效果 而且口服给药在减少不良反应和提高依从性 方面均优于静脉给药 依据卒中治疗学术工业圆桌会议 Stroke Therapy Academic Industry Roundtable STA IR 标准 8 本实验 提示药物对能够实现血管再通的大鼠缺血性脑卒中具 有保护作用 当前灯盏细辛类药物的研究虽然很多 948 医药导报2007年8月第26卷第8期 但是规模很小 时间尚短 还不具备足够的循证医学证 据 因此对它的研究还需要进行下去 以设计出大规 模随机对照实验取得确切的临床证据为目标 参考文献 1 LONGA E Z WEI NSTEI N P R CARLSON S et al Re2 versible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats J Stroke 1989 20 1 84 91 2 李敬诚 董为伟 傅雅各 Sprague2Dawley鼠大脑中动脉 闭塞模型 J 重庆医科大学学报 1992 12 11 118 120 3 张举成 任 驰 肖兰英 灯盏花的研究进展 J 红河 学院学报 2005 3 6 27 29 4 王本祥 现代中药药理与临床 M 天津 天津科技翻 译出版公司 2004 628 629 5 居文政 张 军 谈恒山 等 高效液相 2 质谱联用法 HPLC2 MS 测定灯盏乙素血药浓度及其临床药动学研究 J 中国临床药理学与治疗学 2005 10 3 298 301 6 王立祥 曾季平 黄紫房 等 灯盏乙素对过氧化氢致 PC12细胞损伤的抗氧化作用 J 中国生化药物杂志 2005 26 6 347 349 7 HONG H L I U G Q Scutellarin attenuates oxidative gluta2 mate toxicity in PC12 cells J PlantaM ed 2004 70 5 427 431 8 沈 沸 苗 玲 神经保护药NXY2059研究进展 J 脑 与神经疾病杂志 2005 13 4 320 322 3种百合水煎液抗疲劳与耐低氧作用比较 曾 嵘 李福元 龙洛娜 湖南中医药大学药学院药理教研室 长沙 410007 摘 要 目的 考察卷丹 龙芽 细叶3种百合水煎液的抗疲劳和常压耐低氧作用 方法 取N I H小鼠50只 随机分成5组 每组10只 分别灌服纯化水 卷丹百合水煎液30 g kg2 1 龙芽百合水煎液 30 g kg2 1 细叶百合水煎液 30 g kg2 1及人参水煎液 15 g kg2 1 均每天1次 连续15 d后测定小鼠游泳时间 取小鼠50只 分组 给药方法及时间同 实验 测量小鼠在常压低氧状态下的存活时间 结果 卷丹 龙芽 细叶3种百合水煎液30 g kg2 1对小鼠连续灌胃 15 d 均能明显增强小鼠的耐低氧及抗疲劳作用 与纯化水组比较均差异有显著性 均P 0 05 其中以细叶百合作用最 好 结论 卷丹 龙芽 细叶3种百合水煎液均有较明显的抗疲劳和常压耐低氧作用 其中以细叶百合作用最佳 关键词 卷丹百合 龙芽百合 细叶百合 耐低氧作用 抗疲劳作用 中图分类号 R286 R965 文献标识码 A 文章编号 100420781 2007 0820850202 Comparison of Anti2fatigure and Anti2hypoxia Effects of Three D ifferentL ilium s Decoctted L iquid ZENG Rong L Ifu2yuan LONGLuo2 na Departm ent of Phar m acology School of Phar m acy Hunan College of Traditional ChineseM edicine Changsha410007 China ABSTRACT Objective To study the anti2fatigue effect and the anti2hypoxia effects under nor mal pressure of three different liliums decoctted liquid ofLilium lancifolium Thunb L brownii F E Brown var viridulum Bakerand L pumilum DC M ethods N IH mice were randomly divided into 5 groups Group A were i g distilledwater as negative controls Group B Group C and Group D