细胞膜电压门控钙离子通道蛋白质结构_系统发育分析及应用.pdf

蚕 业 科 学 CANYEKEXUE2007 33 3 收稿日期 2007 06 25 资助项目 华南农业大学校长科学基金新学科扶持项目 编号2006X2 004 作者简介 李文楚 1966 男 湖南 博士 副教授 Tel 134310990852 E2mail liwenchu scau edu cn 细胞膜电压门控钙离子通道蛋白质结构 系统发育分析及应用 李文楚 华南农业大学动物科学学院蚕丝科学系 广州 510642 摘 要 细胞膜上的钙离子通道 VGCCs 由 1 2 2 亚基组成 在昆虫方面分L 非L型和T型 介绍了各 亚基的组成及其功能 采用软件Mega 4绘制进化树研究GenBank已克隆的各种亚基的遗传性 了解物种VGCCs的 分子进化关系 并根据进化树推断出一些 1亚基序列原作者未标记的钙离子通道蛋白类型 从理论上提出研究 家蚕和越北腹露蝗VGCCs的重要性 简要论述了钙离子通道蛋白及其阻滞剂在医药和农业上的应用前景 关键词 昆虫 细胞膜 电压门控钙离子通道 蛋白质结构 系统发育 中图分类号 Q962 S881 文献标识码 A 文章编号 0257 4799 2007 03 0506 08 Protein S tructure and Phylogenesis of Voltage2gated Calcium Channels on the CellM em brane and its App lication L IW en2Chu D ep a rtm ent of Se riculture Sc ience College of Ani m a l Sc ience South China Ag ricultura lU nive rs ity G uangzhou 510642 China Abs trac t Voltage2ga ted ca lc ium channe ls VGCCs of ce llm em b rane a re comp osed of 1 2 2 sub2 units w kick is d ivided into L non2L typ e and T typ e in insec ts The p ap e r introduced the comp os ition of eve ry subunit and the ir func tions Based on the c loned subunits from GenBank the p hylogene tic w as cons truc ted by M ega 4 w hich w as he lp ful to unde rs tand m olecula r evolution of eve ry sp ec ies M eanw hile seve ra l orig ina l authors unlabe lled 1 subunits typ e of ca lc ium channe ls from G enBank w e re conc luded accord ing to the p hy2 logene tic tree The s ignificance of s tudying VGCCs of Bom byx m ori and Fruhs torfe riola tonkinens is W ill was p rop osed Furthe r app lica tion foreg rounds of ca lc ium channe l p rote ins and the ir b locke rs w e re d iscussed in b rief1 Key words Insec t Ce llm em b rane Voltage2ga ted ca lc ium channe ls VGCCs Prote in s truc ture Phylogen2 es is 钙信号是生物细胞信号转导途径中最重要的第 二信使之一 参与生物体的许多生理功能 在昆虫 体内 参与了细胞的增殖 分化 神经递质的释放 对 细胞免疫与凋亡起着重要作用 因此 钙信号是生 物体生命的象征 游离钙的分布 转移及其形成的钙电流是钙信 号的基石 按照细胞膜上的钙移动方向主要分为外 钙内流 少量的内质网 肌质网 ER SR 钙库的存 储与释放 外钙内流主要分电压门控的钙通道 VGCCs 钙库调控 SGCs 受体门控 RGCs 和环 核苷酸门控 CNGs 的钙通道 昆虫各类型VGCCs广泛分布在脑和神经组织 如轴突末梢 中枢神经的胞体 树突近端 神经末 梢 树突干 毛细胞 嗅觉感受器等 对生物体的感 觉 细胞增殖 凋亡等生理功能起着重要作用 各种 通道蛋白的抑制剂和激活剂具有重要生物学意义 如N型通道的阻滞剂可用于临床的止痛 麻醉等 605 1994 2009 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 农业上据此可开展各种动 植物抗药性和抗虫性的 研究开发 同时 由于钙通道蛋白的高度选择性 昆 虫钙通道蛋白毒素转基因作物可能会成为转苏芸金 杆菌B t基因的另类选择 用于农作物害虫的有效 防治 1 钙通道蛋白基因的结构及其功能 脊椎动物VGCCs蛋白基因由 1 2 2 亚 基组成 分L T P Q N R型 目前已克隆到 VGCCs基因的昆虫包括家蝇 M usca dom estica 1 果蝇 D rosophila m elanogaster 2 蜚蠊 B lattella ger2 m anica 3 等 在果蝇克隆到的基因组编码 3个 1 亚基 1个 亚基 3个 2 2 可能还有1个 亚 基 4 仅分L 非L型和T型 根据通道的电压依赖性 可分为高电压门控性 HVA 和低电压门控性 LVA HVA钙通道蛋白 四级结构如图1 由4 5个亚基组成 4 170 250 kD的 1亚基在膜上形成小孔 细胞外的 2亚基 通过二硫键与跨膜的 亚基形成170 kD的 22 复 合体 亚基约50 78 kD 位于细胞内 亚基存在 于部分生物细胞膜上 约25 36 kD 22 参 与调节 1的活化 去活化及电压依赖性 111 1亚基 如图1 1亚基由4个功能区组成 domain 各功能区包含6个跨膜 螺旋片断 S1 S6 图1 VGCCs蛋白的结构及其功能 Fig 1 Structure and function of calcium channel 在S5 S6之间形成一个离子选择性的滤器 由 穿透膜的环肽链构成 4个功能区以循环的方式组 装 这样每个功能区的S5和S6之间都能形成一个 具高度选择性的离子通道 和含有几个保守的谷氨 酸残基形成钙选择性的结构区 S4片断带有正电 荷 可感受电压变化 因此 细胞膜上的钙通道可根 据膜电位的变化而进行开闭 VGCCs 1亚基蛋白 根据电压依赖性和药理学特性 分为钙通道Cav1 1 11 11 4 Cav2 211 21 3 Cav3 311 31 3 5 通过晶体学研究发现 在L型和非L型钙通道蛋 白的第4个功能区C末端 有一个保守的结构单元 I Q 具有许多功能 6 其中之一就是提供Ca 2 钙调 蛋白复合体的结合位点 Ca 2 钙调蛋白 2I Q复合体 受到离子通道钙内流的调节 也受到循环钙浓度的影 响 进而介导钙通道通过钙依赖性的去活化和促进作 用的自动调节 钙通道在细胞膜上形成小孔 去极化 后使得细胞周围的游离钙离子内流 由此介导细胞的 一系列反应 包括肌肉收缩 激素和神经递质的释放 神经传导 酶活性的调节和基因的表达方式 在生物学功能上 昆虫的钙通道蛋白并没有脊椎 705 第3期李文楚等 细胞膜电压门控钙离子通道蛋白质结构 系统发育分析及应用 1994 2009 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 动物那么完整 1亚基在脊椎动物和无脊椎动物体 内的同源性较高 显示出该亚基对动物的基本功能是 必需的 严重缺失 1亚基的果蝇突变体能引起胚胎 致死 4 环形树用家蝇2006265A L型通道 S6 S1 片断做比较区域进行遗传学研究 得出相同的进化 关系树如图2 在进化过程中 果蝇钙通道L和T 型同属一个分支 而非L LVA 属于另一个分支 在无脊椎动物椎实螺中 非L和L T型的遗传距离 也较远 由此可判断非L和L T型钙通道同源于非 常古老的祖先 通过系统研究 从理论上认为果蝇 D1m elanogaster 钙通道蛋白基因AAC47406也是 非L型通道 与已知的非L型U55776位于同一个 节点上且遗传距离为0 相类似的基因还有线虫 C1elegants AAP84337应为T型通道 斑马 鱼 D1rerio AAK84072应为L型通道Cav 112等 果蝇D melanogaster 家蝇M usca domestica 小家鼠M musculus 金仓鼠M auratus 褐家鼠R norvegicus 棒曲霉A clavatus 烟曲霉A fum igatus 克氏原螯虾P clarkii 美国牛蛙R catesbeiana 静水椎实螺L stagnalis 狮鬃水母C capillata 线虫C elegans 扁形虫B candida 虫黄藻珊瑚虫S pistillata 海鞘H roretzi 长枪乌贼L bleekeri 克罗马侬人H sapiens 豚鼠C porcellus 野生穴兔O cuniculus 家牛B taurus 家犬C culus fam iliaris 红原鸡G gallus 斑马鱼D rerio 热带爪蟾X tropicalis 灰色短尾负鼠M doestica 家马E caballus 用Mega 4 7 最大简约法绘制的不同物种及同一物种的不同 1亚基甚至相同 1亚基的同工体的系统发育树 学名后为登录号 环形树用家蝇2006265A L型通道 S6 S1片断于其他相应序列的区域比较 遗传间隙和缺失完全删除 图3 4相同 图中 i 指异构体 The phylogenetic tree of 1subunits in different species and different 1subunits subtype even different isofor ms in the same specieswas bootstrapped byMega 4 7 through maximum parsismonymethod Access numbers of the GenBank sequenceswere followed by scientific name The circle tree was bootstrapped usingM usca domestica2006265A S6 S1 and related domain of other sequences for alignment Gaps MissingData Complete Deletion The following figure 3 4 as the same as here i refers to isoform in the figure 图2 VGCCs通道蛋白 1亚基的蛋白质组成系统树 Fig 2 Phylogenetic tree of amino acids from 1subunit ofVGCCs proteins 805 蚕 业 科 学2007 33 3 1994 2009 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 112 22 亚基 22 亚基的主要功能是启动钙通道的运输功 能 22 亚基的是基因转录过程中产生的 翻译后 形成胞外 2亚基并通过双硫键与跨膜伸展的 亚 基连接 8 亚基在胞质内有一个短尾 tail 图 1 在所有已知的 22 亚基中均缺乏对运输信号的 识別功能 提示 亚基并不参与分子内重排和网络 化机制 然而 促进通道表面蛋白表达的决定性的 分子主要位于 2而非 亚基 2亚基可能间接地 通过结构效应作用于 1亚基控制了网络化 其功 能包括保持钙通道的特性 在细胞表面限制通道蛋 白的降解 9 主要的验证方法是转染和不转染 22 亚基的细胞对 1亚基特异性受体亲和力发生了 变化 10 经过氨基酸序列分析 发现不同物种之间 同源性很高 目前发现 22 有4种 以 2 2 1 4表 示 其中 2 2 1是大脑皮层 扁桃体 脊椎等重要 部位pregabalin的主要结合蛋白 人和鼠的氨基酸 同源性在90 左右 如图3 中国猕猴M mulatta 黑猩猩P troglodytes 非洲爪蟾X laevis Mega 4 7 最小进化法绘制的系统进化树 以果蝇AAL29131序列148 226区域于其他序列相应区域进行比对 小数和整数分别显示了不同物种及同一物种的不同 22 亚基甚至相同 22 亚基的同工体之间的遗传距离及频率 学名后为登录号 Phylogenetic tree was bootstrapped by the softwareMega 4 7 through minimum evolution method usingD melanogaster AAL29131 148 226 domain and related region of other sequences for alignment Decimal fractions and integer present genetic distances and frequency of 2 2 subunits in different species and different 2 2 subunits subtype even different isofor ms in the same species respectively Access numbers of the GenBank sequenceswere followed by scientific name 图3 VGCCsL型通道蛋白 22 亚基的系统发育树 Fig 3 Phylogentetic tree of amino acids from 2 2 subunit ofL type VGCCs proteins 113 亚基 晶体学研究显示了 亚基和位于 1亚基的第 和第 功能区连接的环肽链结合位点的相互作 用 亚基实质上是膜上联结的鸟苷酸激酶家族的 905 第3期李文楚等 细胞膜电压门控钙离子通道蛋白质结构 系统发育分析及应用 1994 2009 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 突变体 主要由N端SH3功能区及密切相连的C末 端鸟苷酸激酶类功能区组成 相互作用区 I D 形成两亲螺旋 无极性的一面则被 亚基的鸟苷酸 激酶的疏水沟包装 图 1 已有研究认为 未形成 复合体的 I D在结构上处于无序状态 只有和 亚 基接触后才形成线绕式的 螺旋 研究证明 亚 基调节VGCCs的活性和通道蛋白去活化的动力学 增加了HVA 1亚基的功能表达 5 理论上归结于 亚基对一定数量的通道特性的影响 通道被打开 的可能性增加 单通道的电导率增加 功能性通道插 入质膜的数量有所增加 或者几个相关进程的组合 但 亚基调节HVA钙通道蛋白特性确切的分子机 制仍有待探索 物种进化过程中 亚基高度保守 果蝇 线 虫 椎实螺 L stagnalis 和斑马鱼 D rerio 的 亚 基氨基酸组成具有高度同源性 图4显示了用最 短序列小家鼠M1m usculus53036进行比对得出的 环形树 恒河猴M mulatta 黑猩猩P trogliodytes 红鳍东方鲀T rubripes 绿斑射水鱼T nigroviridis 珠母贝P fucata 埃及斑蚊A aegyti 冈比亚按蚊A gambiaestr PEST 西方蜂A mellifera 赤拟谷盗T csataneum 果蝇D pseudoobscura 美洲蜘蛛A aperta 三肠虫D dorotocephala 虹鳟O mykiss 曼氏吸血虫S mansoni 日本血吸虫S japonium 猪带绦虫T solium 秀丽线虫C elegans 秀丽隐杆线虫C briggsae 禾草腥黑粉菌T fusca 海冰菌P irgensii 紫球海胆S purpurratus Mega 4 7 最大简约法绘制的不同物种及同一物种的不同 亚基甚至相同 亚基的同工体之间的遗传进化关系 学名后为登录号 环形树用最短序列小家鼠M musculus53036和其他序列相应区域进行比对 Phylogenetic tree was bootstrapped by the softwareMega 4 7 through maximum parsis mony Molecular evolution of subunits in different species and different subunits subtype even different isofor ms in the same specieswere shown on phylogenetic tree Access numbers of the GenBank sequenceswere followed by scientific name The circle tree was bootstrapped using the shortest sequence ofM musculus53036 and related region of other sequences for alignment 图4 VGCCsL型通道蛋白 亚基的系统发育树 Fig 4 Phylogentetic tree of amino acids from subunit ofL type VGCCs proteins 015 蚕 业 科 学2007 33 3 1994 2009 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 在环形树上 果蝇 蚊虫 蜘蛛等昆虫分散在其 他无脊椎动物和脊椎动物中 可能是克隆到不同的 亚基所致 如美洲蜘蛛A1aperta的P30288和 P37045基因像果蝇的两组基因一样 在环形树上的 位置距离较远 但仍然有一定的规律性 在克罗马 侬人 H sapiens 的细胞钙通道内 最多克隆到近20 种不同的 亚基 未标出 总的来看 亚基保守 区域较多 即使在没有亲缘关系的物种内也是如此 114 亚基 亚基的结构有4个预知的跨膜功能区 细胞 内N端和C末端 第1个胞外的环肽链包括一个标 识单元 GLWXXC 1个保守的糖基化位点 1对保 守且可能在第1个胞外环肽链形成双硫键的半胱氨 酸 图 1 目前在GenBank中未找到确切数据显示 无脊椎动物和昆虫细胞钙通道有 亚基 该亚基最早在骨骼肌钙通道被发现 有8种异 构体 1 8 分骨骼肌 1 6 和神经元 亚基 2 5 7 8 后者被证实与神经元钙通道有 关 还可进一步分类为 亚基同工型 11 系统进化 树研究证明了不同类型的 亚基源自于一个远古 的祖先基因 经不断的进化和分化而形成不同的基 因类型 与 22 亚基 亚基一样 其生物学功能 尚未完全明确 1是 亚基第一个通过生化研究 而获得的cDNA克隆 2亚基还可能参与了包含 PDZ功能区 RR KTTPV 的蛋白质的结合 并参与 受体的运输 2亚基因与动物癫痫症 运动性共济 失调有关 从而引起人们的高度关注 2 钙离子通道蛋白研究前景和展望 211 开展昆虫学相关领域的分子生物学研究 进一 步探究钙通道蛋白的结构和功能 钙通道蛋白在自然界普遍存在 从高等动物 低 等动物 到植物和微生物都有相似而又不同的基因 结构 基因和氨基酸序列的高度同源性表明在物种 的进化过程中面临着相同的营养选择 新陈代谢 适 应环境等压力 这一特性也使我们研究不同的生物 体钙通道蛋白质基因变得更为有趣 昆虫钙通道蛋白质基因的克隆 可追朔到1994 年Grabner等 1 利用鲤鱼 C carpio 骨骼肌钙通道 蛋白基因设计引物 进行PCR扩增 在家蝇 M usca dom estica 基因组文库中获得家蝇的钙通道蛋白的 1亚基 1995年 Zheng等 12 通过比对兔的骨骼 肌 心脏 脑 猫的大动脉 鱼的骨骼肌等来源不同的 钙通道蛋白 1基因 从保守区域设计引物 成功获 得果蝇的 1基因DmCa1A和 DmCa1D Jeziorski 等 13 于 1998年用 1亚基第 功能区形成通道的 保守氨基酸IT MEG W和第 功能区S5的氨基酸 MQLFGG设 计 成1对 引 物 克 隆 到 水 母 C1capillata 的钙通道蛋白基因 然而 非L型通 道蛋白的克隆难度很大 Nooney等 14 将其称之为 珍邮收藏 2002年 French等 15 用果蝇的 1基 因DmCa1A和DmCa1D片断为引物克隆到2个小龙 虾 P1interruptus 的钙通道蛋白基因PiCa1A和Pi2 Ca1D PiCa1A与DmCa1A基因在 S1和 S6区 域 同源性达到8314 PiCa1D与DmCa1D基因的 同源性高达8911 PiCa1A和PiCa1D之间同源性 为5717 如前所述 VGCCs的各亚基的功能至今仍未完 全明了 深入发掘和研究 1 2 2 各亚基在 昆虫中的分布和细胞膜上的特殊组合及钙通道的精 密的调节 对了解该基因及其编码的蛋白质的结构 功能具有重要的生物学意义 212 进行药物筛选的研究与开发 获得新型治疗类 药物 VGCCs基因在生物体内广为分布 开展该类通 道阻滞剂和激活剂的研究具有广阔的应用前景 医学上使用的钙通道拮抗剂 calcium channel blocker CCB 对治疗心血管疾病 心绞痛 高血压 心律失常 和增加心肌缺血再灌注损伤的保护作 用 以及对防治哮喘 改善组织血流 抗动脉粥样硬 化 抑制内分泌腺 抗炎 逆转抗肿瘤药物的多药耐 药性 治疗癫痫等都有较好的疗效 目前 已开发出 第3代CCB药物 改善了药物的代谢速率 延长了 药物的半寿期等 CCB主要分二氢吡啶类和非二 氢吡啶类药物 16 17 如氨氯地平 amlodipine 拉西 地平 lacidipine 尼群地平 nitrendipine 等 在蚕学和其他昆虫学的研究中 Dedos等 18 以家 蚕 Bombyx mori 前胸腺细胞 PGs 为研究对象 证明 T型通道的常用阻滞剂 dihydropyridine nitrendipine bepridil mebefradil 都不能阻止重组前胸腺激素引起 的胞内Ca 2 浓度的增长 但镧 La 3 和amiloride却 是有效的T型通道阻滞剂 18 用 forsklin cAMP类 似物82bromo2cAMP激发PGs 可被二氢吡啶类药物 nitrendipine阻断 nitrendipine也能阻断S Bay 115 第3期李文楚等 细胞膜电压门控钙离子通道蛋白质结构 系统发育分析及应用 1994 2009 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved K8644引发的细胞 钙爆发 但不能阻断重组PTTH 激发的钙浓度的增长 在细胞内钙库排空后 nitren2 dipine也无法阻断thapsigargin激发的钙浓度的增长 由此认为在家蚕PGs的Cav通道和cAMP之间存在有 cross2talk 19 20 然而 李杰等 21 对棉铃虫 Helicover2 pa ar m igeraHubner 神经细胞的电生理学实验证实 棉铃虫高电压门控钙通道可能不受胞内cAMP水平 提高的影响 但被cG MP抑制 也受G蛋白激活剂 GTP S和抑制剂GDP S的影响 22 目前 2 芋螺毒 素 23 24 蜘蛛毒素PLTX2 2 ACTX2Hv 2 Agatox2 ins SF1等被认为是有效的昆虫Cav阻滞剂 作者 等 25 用荧光技术标记家蚕血细胞 认为LPS属于一 种激活剂 促进细胞膜上钙通道的开放 而20E基本 上无作用 与脊椎动物比较 相同的阻滞剂对昆虫的 同种Cav其敏感性有所下降 阻滞剂浓度也会影响昆 虫细胞Cav通道 4 但似乎通道的开放与阻滞剂存在 浓度依赖性 昆虫神经细胞 脑 肌肉组织的乙酰胆 碱酯酶 Ach 受体门控钙通道 26 谷氨酸通道等都是 递质浓度依赖型的 27 以上实验提示Cav或cAMP与昆虫的种类 品种 有某种关联 因此 用不同的家蚕抗药性 抗病性 抗逆性品种研究Cav类型具有特别的意义 克隆Cav 基因进行转基因育种有可能获得优质的家蚕抗性 品种 213 通过转基因技术获得抗虫新品系 正如Kang等 11 的论述 昆虫钙通道蛋白转基 因作物可能会成为转苏芸金杆菌B t基因的另类选 择 而且已在烟草中成功地进行了蜘蛛毒素的转基 因工作 植株表现出抗棉铃虫 H ar m igera 和埃及 粘虫 S littoralis 目前 国内已经推广种植转苏芸 金杆菌B t基因棉花抵御棉铃虫的危害 但久而久 之 棉铃虫必然会产生B t抗性 从动 植物对钙离 子的吸收及其重要作用 钙通道蛋白的普遍性存在 以及钙通道蛋白阻滞剂的高度选择性几个要点出 发 通过农作物转毒素蛋白质基因 对农田有害昆虫 进行有效的种群控制 在一定的年限内使用几种抗 虫新品系产生互作效应 可在一定程度上改善害虫 的抗性问题 从而提高作物产量和经济效益 近几年越北腹露蝗 Fruhstorferiolu tonkin ensis w ill 在广东省的危害十分严重 每年均有10多万 hm 2农作物受灾 其中包括约5万hm 2桑园被毁 研 究越北腹露蝗的VGCCs基因结构 通过转毒素蛋白 的方法选育抗越北腹露蝗桑树品种 在虫害发生的 蚕区推广 将带来非常可观的经济效益 此外 研究 开发钙通道蛋白阻滞剂 通过添加或与其他农药配 合使用 亦可开发一类新型的桑园特效农药 参考文献 References 1 GrabnerM Bachmann A Rosenthal F et al Insect calcium channels Molecular cloning of an alpha 12subunit from housefly M usca domestica muscle J FEBS letter 1994 339 1 2 189 194 2 Smith L A Wang Xinjing Peixoto A A et al ADrosophilacal2 cium channel 1 subunit gene maps to a genetic locus associated with behavioral and visual defects J J Neurosci 1996 16 24 7868 7879 3 Hindley J W nschmann S Satinover SM et al Blag6 a tropo2 nin C allergen fromB lattella ger manicawith IgE binding calcium dependence J J Allergy ClinI mmunol 2006 117 6 1389 1395 4 King G F Modulation of insect Cav channels by peptidic spider toxins J Toxicon 2007 49 513 530 5 Dolphin A C G protein modulation of voltage2gated calcium chan2 nels J Phar macol Rev 2003 55 607 627 6 BhlerM RhoadsA Calmodulin 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