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蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达 作者：葛海燕，冯健，贲素琴，倪松石 作者单位：南通大学附属医院呼吸科， 南通 226001 【摘要】目的：观察蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)在内毒素/脂多糖(lipopolysacchride， LPS)诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达上调中可能发挥的作用。方法：以肺微血管内皮细胞为研究对象，用PKC抑制剂预处理内皮细胞，以RT-PCR检测VEGF mRNA水平的表达变化;Western Blot检测其蛋白质水平的表达变化。结果：(1)VEGF mRNA的表达水平与LPS呈剂量和时间依赖的关系;(2)PKC抑制剂calphostin c预处理内皮细胞能显著抑制LPS诱导VEGF mRNA和蛋白的表达。结论：LPS可能通过PKC信号通路而诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达上调。 【关键词】 脂多糖 蛋白激酶C 肺血管内皮细胞 血管内皮细胞生长因子 Protein kinase C mediates lipopolysacchride-induced VEGF gene expression in rat pulmonary microvascular endothelial cells GE Haiyan, FENG Jian, BEN Suqin, et al (Department of Respiratory Medicine, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001) Abstract Objective: To investigate whether lipopolysacchride(LPS)-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was mediated by protein kinase C(PKC). Methods: The rat pulmonary microvascular endothelial cells (RPMVECs) were challenged with LPS before PKC inhibitor(calphostin c) or vehicle, the levels of VEGF mRNA were assayed by RT- PCR, and the levels of VEGF protein were assayed by Western Blot. Results: LPS induced VEGF expression at time and dose dependent manner in RPMVEC. Pretreatment of these cells with the PKC inhibitor(calphostin c) markedly inhibited the LPS-induced VEGF expression. Conclusion: LPS may induce VEGF expression in RPMVEC mediated in part by PKC signal pathway. Key words Lipopolysaccharide; Protein kinase C; Pulmonary microvascular endothelial cell ; Vascular endothelial growth factor血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC) 处在血液与血管平滑肌细胞之间,能分泌多种生理活性物质,调节血管功能，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 即为其中之一。VEGF 具有促进VEC分裂、诱发新血管形成及增加血管通透性的作用1,2。本文以培养的肺微血管内皮细胞为模型, 以细菌脂多糖(lipopolysacchride, LPS) 为诱导因素,从VEGF和蛋白激酶C(protein kinase c, PKC)着手，以阐明其发生机制。 1 材料和方法 1.1 材料 LPS(Escherichia coli,0111:B4), calphostin C均购自Sigma公司，DMEM培养基和Trizol 试剂购自Gibco BRL公司，小牛血清购自Hyclone公司，细胞培养板购自Corning公司，VEGF多克隆抗体购自Santa Cruz公司，ECL Western 检测系统购自Cell Signal公司;PCR逆转录试剂盒购自Fermentas MBI公司。 1.2 方法 1.2.1 大鼠肺微血管内皮细胞分离培养和处理 大鼠肺微血管内皮细胞的分离,培养参照Chen等的方法3，将新生1 d的SD仔鼠处死，乙醇浸泡消毒5 min，取出肺组织用PBS冲洗，将肺的周边切割成1 mm 1 mm 1 mm大小组织块，用吸管将组织块均匀放置在培养瓶内，间距约1 cm。加入含10%胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基，放入37 、含5%CO2、湿度为95%100%的孵箱内，静置培养60 h后去除组织块。34 d更换1次培养液。第12周80%90%细胞单层汇合时，用0.5%胰蛋白酶消化后按13传代。实验用25代细胞。相差显微镜下，细胞呈典型的铺路石状排列，采用CD31抗原间接免疫荧光染色进行鉴定。实验开始前细胞无血清培养24 h。实验细胞分为：(1)正常对照组和用不同浓度LPS刺激内皮细胞24 h，分别测定VEGF mRNA和蛋白的表达;(2)正常对照组和100 ng/ml LPS刺激内皮细胞6 h、12 h、24 h、36 h和48 h，分别测定VEGF mRNA和蛋白的表达;(3)正常对照组和用终浓度分别为0.011 mol/L的calphostin c预处理内皮细胞30 min后，用LPS刺激内皮细胞24 h，分别测定VEGF mRNA和蛋白的表达。 1.2.2 RT-PCR 应用Trizol Reagent从各组内皮细胞中提取总RNA。以Oligo (dT) 为引物,遵循RNA逆转录试剂盒操作步骤合成dscDNA。根据VEGF(Genebank: AF062644)基因序列,用primer premier软件设计的PCR 反应体系中的上下游引物,分别为： 上游引物为:5- CACATAGGAGAGATGAGCTTC-3 下游引物为:5-TCGTCACCGTCGACAGAACAG -3 扩增产物400 bp, GAPDH上下游引物分别为： 上游引物为:5-GAAACTACCTTCAAC TCCATC-3 下游引物为:5-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3 扩增产物250 bp，以逆转录反应的产物dscDNA 为模板进行扩增，反应参数为:94 变性30 s，55 退火1 min，72 延伸1 min，共25 循环，最后于72 继续保温5 min，反应产物以1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。反应结束后,取PCR 反应液(10 l) 进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察结果。 1.2.3 Western Blot 细胞培养至相应的时间后弃去培养液提取蛋白并用改良Lowry法进行蛋白定量，从相应蛋白样品中取等量的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离的蛋白质转印至PVDF膜后，在5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1 h。随后以抗VEGF(11000稀释)孵育过夜。1 PBST洗涤3次后加入相应的二抗孵育2 h。洗涤后以ECL检测，通过X胶片感光而获得蛋白信号。 -actin作为内参。 2 结 果 2.1 LPS诱导内皮细胞VEGF的表达 2.1.1 LPS诱导内皮细胞VEGF表达的剂量依赖性 不同剂量LPS刺激内皮细胞24 h后，随着LPS剂量的升高，VEGF mRNA表达的相对量亦逐渐升高(图1A)。10、100、1000 ng/ml LPS处理组VEGF mRNA表达量高于对照组。VEGF蛋白质表达变化与mRNA表达变化相一致，LPS上调VEGF蛋白表达呈时间依赖关系(图1B)。 2.1.2 LPS诱导内皮细胞VEGF表达的时间依赖性 100 ng/ml LPS刺激内皮细胞后，VEGF mRNA表达相对量逐渐升高，LPS 24 h处理组VEGF mRNA表达量达到峰值(图2A);LPS 刺激36 h后VEGF mRNA表达相对值开始下降。VEGF蛋白质表达变化与mRNA表达变化相一致，LPS上调VEGF蛋白表达呈时间依赖关系(图2B)。 2.2 PKC参与LPS诱导内皮细胞VEGF的表达 用0.011 mol/L calphostin C预处理内皮细胞，其以剂量依赖的方式抑制LPS所诱导的VEGF mRNA和蛋白质表达增加，这提示LPS通过调节PKC信号通路而调节VEGF表达增加(图3)。 3 讨 论 VEGF 是一种能与肝素结合的分子量为3446 kD 的多肽血管生长因子。VEGF 是一高度特异的血管内皮有丝分裂素,具有双重功能: (1) 增加微血管通透性,促进血浆纤维蛋白外渗; (2) 通过与内皮细胞上两个VEGF 受体Flt1 (fms 样酪氨酸激酶) 和flk(胎肝激酶) 作用,直接刺激内皮细胞增殖，并促进内皮细胞移位,有利于炎症细胞向邻近结缔组织基质扩散,在炎症的发生和发展中发挥了重要作用4,5。本文利用LPS为诱导剂来刺激PMVEC ,结果表明:正常PMVEC 仅有微量的VEGF的基础表达,LPS 的刺激能显著促进PMVEC 表达VEGF,呈现时间 剂量依赖方式。提示可能是由于内毒素致伤后,通过某种途径或因素促进了PMVEC VEGF的表达,从而为血管通透性增加提供了物质基础,也是PMN大量于肺内扣押及肺组织广泛损伤的前提。 对于LPS引起VEGF表达调控的机制，Ramanathan等报道LPS介导VEGF的表达是NF- B依赖的。LPS通过与Toll样受体(toll-like receptor 4,TLR-4)结合，激活TNF受体相关因子-6(tumor necrosis factor associated factor-6, TRAF-6),TRAF-6又激活下游的NF- B诱导激酶(NF- B-inducing kinase，NIK)，它们又激活I- B磷酸激酶，引起I- B磷酸化而降解，从而引起NF- B的转核活化6。PKC是细胞内重要的信号转导通路，可把细胞外刺激转到细胞内，引起核反应，在细胞的增殖、分化和应激的调控中起重要作用。已有研究表明PKC激动剂佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)能显著增加内皮细胞VEGF的表达，而抑制PKC的活性能逆转PMA所诱导的VEGF表达7。PKC可能通过增加VEGF mRNA的稳定性上调VEGF的表达。此外，也有研究发现LPS刺激内皮细胞PKC活化而调节细胞通透性改变8，那么PKC是否参与了LPS诱导VEGF的表达调控，文献报道较少。 本研究结果发现，cal