生物化学技术2 沉淀法.ppt

第二章沉淀法 沉淀法是分离纯化生命大分子物质常用的一种经典方法 其特点是 操作简单 成本低廉常见的方法有盐析 有机溶剂沉淀 蛋白质沉淀 PEG沉淀 选择性沉淀 结晶沉淀等 掌握沉淀法的基本原理及影响因素掌握沉淀类型及其在制备蛋白质 核酸中作用原理熟悉沉淀法在制备蛋白质和核酸过程中的实际运用 目的 第一节基本原理与沉淀类型 一 基本原理 根据同一溶剂中有效成分与杂质溶解度差异 选用某种溶液系统 使所需有效成分出现最大溶解度 而杂质出现最小溶解度 或者相反 然后溶解度小者以沉淀的形式析出 达到有效成分与杂质分离的目的 根据蛋白质和核酸在组成 结构及性质等方面的明显差异 所以从生物材料中提取制备这两类物质 一般选用的试剂和操作方法也不完全相同 二 制备蛋白质 一 盐析法 1 原理 蛋白质在稀盐溶液中 溶解度随盐浓度的增高而上升 盐溶 但当盐浓度增加到一定数值时 其溶解度有随盐浓度逐渐下降 直至蛋白质析出 盐析 盐析的内因是当盐浓度达到一定程度时 水的活度降低 导致蛋白质分子表面电荷中和 水化膜相继破坏 蛋白质分子聚集而析出沉淀 2 基本步骤 选择一定浓度的盐溶液 使部分杂质 盐析 有效成分 盐溶 0 25 的 NH4 2SO4 离心分离上清 再调一定浓度盐 25 60 饱和盐溶液 使有效成分 盐析 离心收集沉淀物 即为初步纯化的有效成分 1 盐分级沉淀 盐的选择 在蛋白质盐析时 常选用的盐是 NH4 2SO4 NH4 2SO4的优点 溶解度大 对温度不敏感 分离效果好 如有时一次可除去75 的杂蛋白 NH4 2SO4本身有稳定蛋白质结构的作用 价格低廉 废液还可作肥料缺点 与其他盐一样 若需进一步纯化 需脱盐处理 NH4 2SO4盐析 固体法 在大体积的粗提液中逐渐加入固体 NH4 2SO4 边加边搅拌 缓缓加入 在此过程中 溶液 NH4 2SO4的浓度不断升高 水分子不断与 NH4 2SO4结合 当加入的 NH4 2SO4达到盐析点时 蛋白质就会沉淀出来 例 在尿素酶抽提液中加入 NH4 2SO4 当饱和度达为35 时 尿素酶基本留在溶液中 但当饱和度达到55 时 尿素酶几乎全部沉淀至于蛋白质溶液中加多少 NH4 2SO4使其饱和度符合蛋白质盐析 可查表2 2 或用下列公式计算 20 25 表示一升溶液中需加入的 NH4 2SO4的克数 硫酸铵对尿素酶的沉淀作用 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 饱和溶液法 在pro溶液中加入预先调好的饱和 NH4 2SO4溶液 不同的饱和度所需的 NH4 2SO4的量用下式计算 表示需加入 NH4 2SO4溶液的体积 ml 表示原来溶液的体积 表示始 终盐的饱和度 表示需加入 NH4 2SO4溶液的饱和度 此法较固体法温和 但不宜用于大体积样品 否则引起样品液体积增加 计算不准确 不能达到预期的目的 透吸法 将装有pro溶液的透吸袋放入一定浓度大体积盐溶液中 利用半透膜透吸改变pro溶液中的盐浓度由于此法的盐浓度是以连续状态变化的 可避免局部盐浓度过高而产生的不良影响 所以分离效果好但透吸袋体积有限 盐析速度缓慢 NH4 2SO4消耗多等原因 致使此法仅用于要求较精确 样品体积小的试验过程中 难于放大 2 制作盐析曲线 用盐析法沉淀分离pro样品是 NH4 2SO4的 盐析 浓度很关键 所需的浓度范围要通过具体试验确定 取一定体积已测含量的pro或酶的待分离溶液 调pH至稳定范围分6 10次加入不同量的 NH4 2SO4至出现浑浊时 分离上清 如此反复6 10次 分别收集每次的沉淀根据每次沉淀的pro或酶的量和相应的 NH4 2SO4浓度之间作图 即得盐析曲线 如图2 1 参照表2 3的分级试验方法 再根据所用生物材料来源的难易程度 以及对有效成分纯度和得率的要求 先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致框架 然后经过反复试验就能确定最佳盐析范围 即 NH4 2SO4的浓度范围 但若生物材料来源容易 主要考虑提高纯化倍数 得率高低可视为次要因数 若材料来源困难 则主要考虑得率 典型盐析曲线 由表可知 若生物材料来源容易 主要是考虑提高纯化倍数时 选择48 65 盐饱和分级范围 酶的纯化倍数可达3 0 而得率仅为75 若生物材料来源较困难 主要是考虑提高收得率时 则选择45 70 甚至45 75 盐饱和分级范围 酶的收得率可达80 以上 而纯化倍数将 2 4 3 影响盐析的因素 盐析常数 Ks 每种pro在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间存在如下关系S表示有效成分在水中的溶解度 M表示摩尔浓度 Ks表示有效成分在特定条件下的恒定值 Ks值越大 则意味着有效成分溶解度降低的速度随着盐浓度的增加而快速降低 因此 对一种有效成分而言 Ks值越大 分级范围就越窄 盐析效果就越好 Ks还受pro本身的性质 溶液的pH 温度及盐的种类等因素的影响 在pH7 0溶液中几种蛋白质的 和KS常数 溶解度S以mg ml表示 盐分级范围的差异性 在pro分离过程中 若每一种pro的Ks都很大 分离效果不一定好 因为盐析效果还与盐析范围的差异性有关各pro的Ks大 盐析范围差异明显 则分离效果好 如图2 2中A C各pro的Ks大 盐析范围差异较小 则分离效果不好 如图2 2中A B pH和盐浓度 有效成分的溶解度会受到pH和盐浓度的显著影响例 兔肌磷酸甘油醛脱氢酶 pI约8 5 可溶于pH6 0 3 2mmol L的 NH4 SO4溶液中 但若调节pH 则立即产生沉淀 这说明选择适当pH的盐溶液可提高盐析的效果 一般来说 在分级盐析过程中 第一次盐析时 除去杂质 pH应偏离有效成分的pI值 而接近杂质的pI值 而在第二次盐析时 沉淀有效成分 pH应调节至接近有效成分的pI值 蛋白质的纯度和浓度 蛋白质存在的形式 均一的还是混合的 和浓度不同 盐析范围和溶解度也不一样 在混合的pro溶液中 不同分子间的相互作用会发生共沉淀作用 Pro浓度越高 这种现象越明显 盐析分离效果则越差 因此 一般控制样品液Pro浓度在0 2 2 之间为宜 其他 在进行盐析沉淀时 有时需在溶液中加1mmol L的EDTA Na2盐 以除去沉淀剂中带入的金属离子 另外 加 NH4 2SO4沉淀的时间要控制好 过长或过短都不宜 一般控制在2h左右 4 脱盐 常用方法 凝胶过滤法和透析法 透析操作的注意事项 透析袋处理 市售透析袋要D W洗净 检查无漏洞时再用 若用来去除某些易被金属离子或水解酶破坏的样品中的盐时 透析袋应用含EDTA Na2的NaHCO3溶液中煮沸10min 并经D W煮沸 漂洗后再用透析液的选择 透析液一般为低离子强度的中性缓冲液 对含有辅基的酶透析时 宜在透析液中加入适量的辅基或保护辅基的试剂 为防止微生物的生长 透析应在4 进行或在透析液中添加0 02 的NaN3 二 有机溶剂沉淀法 1 原理 与盐溶液一样具有脱水作用 使Pro表面的水化膜破坏降低溶剂系统的介电常数 即降低极性 而蛋白质为水溶性物质 2 常用有机溶剂 MeOH EtOH Me2CO等3 有机溶剂的使用量 V表示加入有机溶剂的体积 V0表示蛋白溶液的原始体积S1表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度 体积百分浓度 S2表示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度 体积百分浓度 C表示有机溶剂的浓度 如无水EtOH 则C 100 95 EtOH 则C 95 4 注意事项 中性盐作用 即在有机溶剂沉淀时 加入适量中性盐 一方面可增加Pro在有机溶剂中的溶解度 另一方面可防止Pro变性 0 05 提高分级效果低温下操作 因为有机溶剂加入水溶剂中会放热 若不注意降温 容易导致Pro变性多价阳离子作用 有些Pro能和多价阳离子 如Zn Cu 等 结合形成复合物 致使Pro在有机溶剂中溶解度降低 这对在高浓度溶剂中才能沉淀的Pro特别有益 如在某些Pro溶液中加入0 005 0 02mmol L的Zn 就可节省大量有机溶剂 使Pro有效得沉淀出来 三 蛋白质沉淀法 1 碱性蛋白质 多价阳离子的碱性蛋白质 如 鱼精蛋白 既能有效得沉淀核酸 又能沉淀Pro应用 鱼精蛋白加入到部分纯化的酵母PFK溶液时 溶液中的酶蛋白便会吸附到鱼精蛋白 核酸沉淀物上 将沉淀物用0 1mol L磷酸缓冲液洗脱 收集的PFK纯度提高了9倍 从深红螺菌中分离PEP羟基激酶时 加鱼精蛋白处理 可除去其中3 4的杂蛋白 而酶蛋白仍然保留在溶液中缺点 多价阳离子的碱性蛋白质不可再利用 且其水溶液pH2 3 要小心调中性后才能应用 2 凝集素 目前研究得比较清楚的是植物血球凝集素 如伴刀豆蛋白 它是一种特殊的蛋白质 主要对糖蛋白糖链末端序列有特异 明显的凝集力例 伴刀豆蛋白 对含有G 甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异凝集沉淀作用 通过离心可把糖蛋白与一般蛋白质分离开 获得的凝集素 糖蛋白复合物用单糖作抑制剂即可解离优点 条件温和 专一性强 3 重金属 重金属 Pb2 Hg2 也能与蛋白质沉淀 纯化Pro 但由于重金属易使Pro变性 故应用时要控制在较温和的条件下进行 并及时除去重金属 四 PEG沉淀法 此法应用较广 属于非离子型聚合物引起的Pro沉淀作用 沉淀条件温和 不易引起Pro变性 且沉淀较完全如用20 PEG 6000或57 PEG 400可使 葡萄糖苷酶80 发生沉淀 五 选择性沉淀 利用目的Pro与杂Pro在不同物理化学环境下的稳定性不同 如温度 酸碱度 有机溶剂等 用选择性沉淀法 使杂Pro变性沉淀 而目的Pro存在于溶液中或发生可逆性沉淀 从而使目的Pro得到纯化 例 酵母干粉抽提液升温至55 20min后迅速冷却 离心除去热变性的Pro 上清液中为对热稳定的醇脱氢酶 假单胞菌培养液中加HCl调pH至4 0 得到碱性脂酶的沉淀 六 结晶沉淀法 操作 将欲结晶的物质溶解于适当溶剂中 加入适量的盐 如20 40 NH4 2SO4 或有机溶剂 如EtOH MeOH等 使其溶解度降低至接近饱和的临界浓度或刚刚开始出现沉淀 调节pH至等电点附近 控制温度4 左右 使溶解度进一步降低 放置一段时间 陈化 即可得到结晶沉淀 对于难结晶的物质 有时采用加入少量 晶种 引子 或进行适当搅拌 或在容器壁上用玻棒磨檫等方法 可加速结晶 三 制备核酸 从生物材料 如动物组织 线粒体 叶绿体 以及微生物中的真菌 细菌和病毒等 中分离出的DNA或RNA 往往是以DNA Pro DNP 或RNA Pro RNP 复合物的形式存在的 所以制备核酸样品时 首先需使复合物解聚 释放出核酸 除去Pro 然后用沉淀法得到核酸 一 DNP RNP复合物的解聚 在破细胞溶液中 加入适量的阴离子去污剂SDS或十二烷基肌氨酸钠 脱氧胆酸钠DOC 聚氧乙基十六烷基酚醚 TWeen等 使DNP RNP解聚释放出核酸加入适量醋酸钾溶液沉淀SDS pro和SDS K 等 然后离心除去沉淀分离上清 即为初步纯化的核酸制品 1 加去污剂 2 加有机溶剂 用有机溶剂反复处理抽提液 直至处理液经离心后 水相 有机相界面交接出无变性的pro为止注意有机溶剂的祛除 一般用乙醚提取 再在低温蒸馏除净乙醚 3 蛋白酶处理 用蛋白水解酶除去复合物中的pro组分 此法条件温和 一般不会造成对核酸的破坏常用的pro水解酶有 溶菌酶 蛋白酶K 蛋白酶E等 二 消除多糖等杂质 1 多糖 抽提前用 饥饿法 可减少生物材料中贮存多糖 如淀粉 糖原等 的含量混杂于核酸提取液中的多糖类杂质 一般用异丙醇 十六烷基三甲基溴化铵 CTAB 适用于酸性多糖 等选择性沉淀剂除去 此外 也可用等体积2 5mol L磷酸缓冲液和等体积乙二醇甲醚处理 经离心 多糖位于中部 核酸位于上层乙二醇甲醚中 2 DNA与RNA的分离 盐析法DNA 易溶于1 2mol LNaCl溶液 难溶于0 14mol LNaCl溶液原理RNA 易溶于0 14mol LNaCl溶液 难溶于1 2mol LNaCl溶液例 从小牛胸腺提取DNA 用0 14mol LNaCl溶液反复洗涤 绞碎 离心 结果RNA存在于溶液 DNA存在于沉淀中 酶水解法在提取DNA时 用RNase水解RNA RNase中混有的DNase用100 热处理15min在提取RNA时 用DNase水解DNA DNase中混有的RNase 在Ca2 存在条件下 加蛋白酶K作用或加碘乙酸钠处理 使RNase破坏 三 核酸沉淀 在核酸溶液中加入某些有机溶剂或非离子型聚合物试剂时 核酸会被有效地沉淀 1 有机溶剂沉淀法 乙醇 盐溶液操作 在核酸溶液 0 1 l ml 中加入0 1mol LNaCl和2倍量体积 DNA 或2 5倍体积 RNA 的冷无水乙醇 就可将核酸沉淀出来注意 沉淀时间与温度 核酸分子大小 浓度有关 DNA 1kb时 室温数分钟 高速离心即可 16000rpm 15min DNA 1kb时 70 数小时 十几小时 高速离心即可DNA 200bp时 加有机溶剂前需加入0 01mol L的MgCl2 促进沉淀 异丙醇操作 在含有DNA的溶液中 加入0 3mol L的NaAC和0 54 1倍体积的异丙醇 短时间放置后离心 得到核酸沉淀核酸沉淀的形状与其分子量密切相关 M 106Da的双链DNA呈丝状纤维样 小分子量的双链DNA呈凝胶状缺点 异丙醇沸点高 不易从核酸中除去 且蔗糖 NaCl等易和DNA共沉淀 2 PEG沉淀法 加PEG 0 5mol LNaCl溶液到核酸溶液中 可使 2kb的DNA片段沉淀 沉淀时 PEG的浓度与DNA片段的分子量成反比 DNA 1