基因工程原理beike.ppt

基因工程原理 第一章基因与基因工程 1 1基因的现代概念1903Sutton Boveri遗传的染色体学说1909Johannsen基因1910Morgan基因学说1941Beadle Tatum一基因一酶1944Avery 遗传物质DNA1953Watson Crick双螺旋1973基因工程诞生 分子水平 跳跃基因 1956McClingtock 断裂基因 外显子 内含子 重复基因 真核生物 重叠基因 原核生物 假基因 1977G Jacq珠蛋白 1 2基因工程的诞生理论基础 1 遗传的物质基础DNA2 基因的自我复制和传递 1953 3 遗传信息的流向及表达问题的阐明 1961操纵子 1966中心法则 技术基础 1 工具酶 1967连接酶 70内切酶 2 载体3 逆转录酶发现 70 中心法则的完善助产士1972 P Berg 美 斯坦福大学DNA体外重组1973 S Cohen诞生 1973 1 3基因工程研究内容基因工程 在体外将核酸分子插入病毒 质粒或其他的载体分子上 构成遗传物质的新组合 并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内 而能持续稳定的遗传 内容 步骤 1 分离目的DNA片段2 与载体相连成重组DNA分子3 重组DNA分子引入受体细胞4 扩增 获得大量细胞繁殖群体5 筛选具有重组DNA分子的细胞克隆6 目的基因实现功能蛋白的表达 第二章基本技术 凝胶电泳 核酸分子杂交 序列分析 细胞转化 DNA分子切割与连接等2 1凝胶电泳1 种类 琼脂糖0 2 50kb 聚丙烯酰胺1 1000bp2 原理 电泳的迁移率 核酸的取决于大小与构型 共价闭合螺旋状环形DNA 开环 线形 3 E B 2 2细胞转化存在问题 外源DNA片段难直接导入受体细胞即使进入无法复制诱导受体菌成感受态 2 3核酸分子杂交1 种类 Southern Northern2 原理 互补的DNA或RNA混合 同源区段退火形成双链结构3 步骤 核酸印迹转移 核酸杂交 Southern硝酸纤维素滤膜 尼龙膜 Northern叠氮化的活性滤膜 4 用途 亲缘关系 核酸片段中某一特定基因的位置 2 4DNA序列分析Maxam Gilbert化学裂解法 Sanger双脱氧链末端终止法Sanger双脱氧链末端终止法原理 2 3 双脱氧核苷三磷酸参入寡核苷酸链的3 末端 无3 OH末端 反应终止 Maxam Gilbert化学裂解法原理 用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段 造成碱基特异切割 第三章基因操作的工具酶 限制性核酸内切酶 连接酶 DNA聚合酶 修饰酶 核酸外切酶 单链核酸内切酶 3 1限制性核酸内切酶定义分类 1970H O Smith K W Wilcon从流感嗜血菌Rd株分离 命名 R Hind 型基本特征 特异识别序列 断裂类型 粘性 平 影响活性因素 纯度 甲基化 分子结构 温度 缓冲液 同尾酶 同裂酶 3 2DNA连接酶 1967 作用机理 封闭双螺旋DNA上缺口类型 DNA连接酶 T4DNA连接酶 DNA片段的连接 粘性末端平末端 1 T4DNA连接酶 2 同聚物加尾法 末端脱氧核苷酸转移酶3 OH 3 衔接物连接法 10 12 酶识别位点 4 接头连接法 粘 平 3 3DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶 1957 美 Kornberg1 多功能5 3 聚合酶 5 3 外切酶 3 5 外切酶2 DNA杂交探针的制备缺口转移法 大肠杆菌DNA聚合酶 的Klenow片段 Klenow酶 1 活性5 3 聚合酶 3 5 外切酶2 用途修补3 隐蔽末端 标记DNA片段末端 CDNA克隆的第2链CDNA的合成 DNA测序 T4DNA聚合酶5 3 聚合酶 3 5 外切酶 逆转录酶1 活性RNA依赖的DNA聚合酶 DNA依赖的DNA聚合酶 外切酶活性 3 4DNA和RNA的修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶 T4多核苷酸激酶 碱性磷酸酶末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾 T4多核苷酸激酶与DNA分子的5 末端的标记 碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用 第四章基因克隆载体 质粒载体 15kb噬菌体载体 15kbCosmid 31 45kb单链DNA噬菌体M13 1kb动物病毒 4 1质粒载体天然质粒 F R Col天然质粒特性双链闭合环状DNA分子复制类型不亲和性 质粒载体的选择质粒载体具备条件 自主复制 限制酶单一切割位点 筛选标记 小 多拷贝大肠杆菌质粒载体 PSC101 9 09kb 1973 ColE1 6 3kb pBR322 4 3kb 4 2噬菌体载体噬菌体一般特性核酸 蛋白质外壳温和 烈性 噬菌体载体 1974 1 噬菌体DNA分子 48502bp 2 噬菌体载体的构建原理 删除多余限制位点e g 5EcoR 步骤 类型 插入型 一个替换型 成对3 常用 噬菌体载体凯伦噬菌体载体 1977F R Blattner等4 应用体外包装 5 75 23kb 4 3柯斯质粒载体柯斯质粒 噬菌体cos位点 质粒复制子特点 具有 噬菌体特性 质粒载体的特性 高容量应用 4 4单链DNA噬菌体载体M13噬菌体生物学特性 M13噬菌体载体非必要区 IS类型 插入一个lac操纵子片段 在上一基础上再插入一多限制酶的人工接头应用 4 5真核细胞的克隆载体植物基因克隆的载体 Ti质粒Ti质粒的结构和特性环状 双链DNA 1 5 2 105 T DNA 动物基因克隆的载体 技术 电穿孔 显微注射 原生质体融合 病毒载体SV40病毒 猿猴空泡病毒40 5 2kbSV40病毒DNA 蛋白外壳2 SV40病毒载体取代型的重组病毒载体重组的病毒 质粒载体 4 6噬菌粒载体 phagemid 质粒 单链噬菌体载体 3000bp 第五章基因分离与重组及重组体向宿主细胞的导入 基因克隆的基本步骤 1 目的DNA片段的获得2与适当的载体体外连接3 重组体导入寄主细胞4 选择与鉴定重组体的克隆 5 1目的基因的获得化学法 基因文库钓取 mRNA逆转录1 化学法合成150 200bp 干扰素基因2 构建基因文库钓取目的基因 1 基因文库 载体 噬菌体25kb 质粒15kb 柯斯质粒45kb 2 适当的基因探针 3 逆转录法特异高度分化组织 总RNA 5 2重组体的构建1 外源DNA片段定向插入载体分子 2 非互补粘性末端DNA分子的连接 1 接头 2 衔接物 3 同聚物加尾 5 3重组体向宿主细胞的导入宿主细胞 能复制表达外源DNA导入途径 转化或转染 显微注射 电穿孔1 重组体DNA分子的转化或转染关键 Cacl2 2 体外包装的 噬菌体的转导 1 重组 噬菌体DNA 2 体外包装 3 注入寄主细胞 第六章重组体克隆的筛选与鉴定 检测方法 遗传检测法 免疫化学法 物理检测法 核酸杂交法 6 1遗传检测法1 利用载体提供发表型特征 筛选重组体分子的直接选择法 1 抗药性标记插入失活筛选法 2 营养记号 2 根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法基本原理 克隆片段提供新表型特征 6 2物理检测法1 凝胶电泳检测法分子量2 R 环检测法基本原理 变性 高浓度甲酰胺 电镜检测 6 3菌落或噬菌斑杂交筛选法原理 放射性同位素标记探针惊进行杂交 利用同源DNA碱基配对原则检测特定的重组克隆 6 4免疫化学检测法基本原理 目的基因表达产物做抗原 以该产物的免疫血清做抗体 通过抗原 抗体反应检测目的基因克隆1 放射性抗体测定法原理 2 免疫沉淀检测法原理 抗原抗体反应 培养基加入抗体 重组的克隆菌落分泌该蛋白质 在菌落的周围会出现一条叫做沉淀素的抗体 抗原沉淀物所形成的白色圆圈 第七章克隆基因的表达 研究意义 提供新的研究手段 揭示蛋白质结构与功能的关系 利用重组DNA技术产生蛋白质 7 1基因表达的基本条件转录 转译 加工7 2克隆基因的高效表达1 启动子结构 1 保守序列 2 常用启动子 lac 2 转译启始序列 1 保守结构 启始密码子AUG SD序列 终止密码子3 启动子同克隆基因间隔距离 4 转录终止区5 质粒拷贝数及稳定性 7 3原核有效表达载体的构建1 只带E coli启动