western blot试验操作指南.doc

蛋白表达研究系列之Western Blot试验操作指南目 录目录1一、总蛋白的提取21 试验类型和蛋白类型22 样品组织类型33 蛋白表达峰度判断44 总蛋白提取的基本步骤44.1细胞样品总蛋白的提取操作步骤54.2组织样品总蛋白的提取操作步骤5二、总蛋白BCA定量6三、SDS-PAGE凝胶电泳7四、转膜8五、信号增强剂处理膜9六、封闭、一抗孵育、二抗孵育91 封闭92 一抗孵育93 二抗孵育13七、曝光显色14八、灰度分析15九、抗体及相关溶液配制151 抗体172 相关溶液配制表17蛋白检测相对于DNA/RNA的检测来讲要困难许多，Western Blot作为蛋白检测的经典方法短时间内仍然无法被取代。Western Blot的原理并不复杂，网上有很多这方面的材料，这里不作过多的介绍。虽然原理、操作并不复杂，但做好Western Blot、得到满意的图片并非易事。其操作过程中涉及到：蛋白提取、电泳、转膜、杂交、显色、抗体的选择、试剂的选择、设备应用等诸多内容，其中每一个环节的差错对最后的试验结果都会产生不小的影响，最终导致试验失败。很多同学都在抱怨自己的Western Blot没有信号、目的条带太弱、杂带太多、条带弯曲、泳道中有涂抹状背景等诸多问题，大部分情况都会最终把矛头指向抗体，认为这个抗体质量不好。抗体质量肯定会对试验产生相当重要的影响，但绝不是全部。你的操作方法可能是对的，但，是否合理、是否适合你的试验要求，你可能未必了解。我们课题组Western Blot的任务量极重（每年ECL的用量都在5L以上），课题组里面的一些同学总是在不停的问我关于条件优化的问题，我不可能为每一个人找到问题的关键点，因此，写一份关于Western Blot的系统性材料非常有必要，希望你们可以针对自己的问题，自我分析、自我解决，这样也能锻炼你们独立解决问题的能力。一、总蛋白的提取总蛋白作为Western Blot试验的原始材料，可以说是试验的根基。蛋白提取不好、提取效率差、试剂选取不合理，后面的试验就基本不用做了，肯定会发生没有信号、信号弱、背景高、泳道中有涂抹状背景等问题。做试验之前这些信息需要考虑和查询：（1）试验类型；（2）目的蛋白类型；（3）样品组织类型；（4）蛋白表达峰度判断。1 试验类型和蛋白类型（1）如果是IP试验，样品的蛋白提取务必使用碧云天的Western及IP细胞裂解液（货号：P0013）。HaiGene的超强RIPA裂解液虽然能有效的裂解样品，但其成分对后续分离蛋白复合物有影响。如果是细胞核内的蛋白研究，样品裂解30min后，放置到超生破碎仪上3050W，工作4s，间隙6s，超声5次。这样能有效的将细胞核裂解，并打碎基因组DNA和RNA，有两个目的：第一，碧云天的Western及IP细胞裂解液对细胞核有一定的裂解能力，但并不能完全裂解细胞核，通过超声可将细胞核完全裂解，从而释放更多的核蛋白，这样后续检测能获得更高的灵敏度；第二，细胞核中的蛋白总是与基因组DNA结合在一起，如果不将DNA打碎，核蛋白仍然跟基因组DNA结合在一起，样品离心过程中，容易发生基因组DNA-蛋白复合物大分子沉淀，从而丢失这部分核蛋白，通过超声将DNA打碎后，彻底释放核蛋白，从而获得更多的目的蛋白。（2）如果是单纯的Western Blot试验，使用HaiGene的超强RIPA裂解液（货号：C2501）和Benzonase核酸酶（货号：C2001）。这个RIPA裂解液裂解能力更强，可获得更多的总蛋白，它可以完全裂解细胞核、线粒体，并可提取到更多的膜蛋白。如果后续杂交的蛋白有细胞核、线粒体和膜蛋白，则务必使用这个RIPA裂解液，它能提取到很多Western及IP细胞裂解液提取不到的蛋白。但使用HaiGene的超强RIPA裂解液必须要使用Benzonase核酸酶，这个酶能迅速降解基因组DNA和RNA，从而使样品不粘稠（粘稠的样品，在胶孔上样时将很困难），还能提高总蛋白提取效率（尤其是核蛋白）。总结：根据试验类型和目的蛋白的表达定位情况，选取合适的裂解液，确定是否需要超声处理即可。2 样品组织类型我们组的样品就两种：细胞和动物组织。（1）先说一下细胞样品的处理，细胞样品由于很纯、都是单个细胞，容易裂解，处理非常容易。可能遗漏点在凋亡（或死亡）的那部分悬浮细胞。Western Blot试验要求细胞至少6孔板一孔（融合度85），最好23孔，这样细胞量比较足。当然也要看蛋白的表达峰度情况，蛋白表达峰度低的可用一个25cm2培养瓶的细胞。细胞于胰酶消化、终止后，8000rmp离心510min（1.5ml EP管），留底部细胞团块，加入1ml PBS，不重悬底部细胞，只是冲洗一下EP管，再离心2min。倒掉PBS，用移液器将剩余PBS吸取干净，再加入4050l PBS重悬细胞*1，加入150l裂解液*2，裂解细胞就可以了。对于做凋亡研究或通路分析的试验，千万不要忽视凋亡或死亡的那部分细胞，也许想要的信息就在这里面。所以培养上清液里面，离心收集这部分细胞，把它加入到处理的贴壁细胞里面。处理方法：将培养上清液8000rpm离心后100l PBS重悬加入到胰酶消化、终止后的溶液中就可以了。*1有同学问为什么要加PBS再重悬细胞？细胞用PBS可很快吹散，便于后面裂解液充分发挥作用，使得提取效率更高，要是直接加入裂解液的话，细胞容易聚团不能充分裂解，会造成不同EP管中的样品提取效率存在差异，从而使得总蛋白浓度存在差异。在起始细胞数量相差不多的情况下，总蛋白浓度近似，后续做内参杂交时几乎是一致的，减少了内参杂交的重复次数。实践证明，这样的总蛋白样品可以不需要使用BCA进行再定量均一化处理。*2150l裂解液用量是可以满足大部分试验的，细胞少的话可使用100l，多则可使用200l甚至300l，自己可把握。（2）组织样品。不管是新鲜组织还是冻存组织，处理方法是相同的。冻存的组织于-80保存的话，5年内是没有问题的。不过不要反复冻融，因此采样的时候要求必须分装于1.5ml的EP管中，每管放置300500mg，足够23次的提取试验即可。对于柔软的组织（肝脏、肾脏、脑、肌肉等），可使用电动组织研磨器研磨，骨骼、皮肤、血管等富含胶原等硬类组织还是使用液氮下研钵处理最好。柔软的组织使用研钵处理会更好，总之还没有什么方法能超过液氮下研磨这个方法。组织样品由于富含的细胞类型往往比较多，采集部位稍有差异就会造成待研究细胞数量上的差别，这为后续定量带来了一定的误差。实践证明组织样品相比较细胞样品来讲，更难以得到理想的目的条带。具体原因未知，但应该与混杂的细胞类型有绝对的关系。因此组织蛋白样品最好使用裂解能力更强的RIPA裂解液，以获得更高浓度的上样蛋白。组织样品的蛋白要求每泳道使用40g左右的蛋白（细胞样品10g就够了）。组织蛋白样品除了提取的蛋白外还会含有大量的RNA、基因组DNA等杂质，这些物质都会造成泳道中的涂抹状背景，因此使用Benzonase核酸酶（货号：C2001）降解这些杂质非常有必要，它除了能改善背景外，还能改善电泳带形、降低上样粘度、提高蛋白提取效率。组织蛋白样品提取完毕后，务必使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量处理，将蛋白样品调整到相同的浓度，便于内参的杂交和后续WB的灰度分析比较。（3）关于蛋白酶抑制剂的使用，如果要WB的抗体有磷酸抗体的话，裂解样品时务必加入终浓度为1mM的PMSF，否则可加可不加，影响不大。虽然裂解液中已经含有部分抑制剂，但加入PMSF来抑制丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶还是很有必要的。3 蛋白表达峰度判断老实说这个工作是比较困难的，但它又非常重要，所以我们还要是找一些方法来判断它。高峰度的蛋白检测当然要容易很多，低峰度表达的检测要困难很多，尤其对于组织蛋白样品，本身组织样品细胞类型多，目的研究细胞含量可能偏少，这会造成后续检测不到信号。很多同学看到抗体供应商杂交的细胞样品条带还不错，怎么自己杂交的组织样品就没有目的条带或杂带很多呢？大概这个原因比较重要吧。判断的方法来看，可通过参考文献看一下其它研究者的WB试验、免疫组化、免疫荧光的试验图片。阳性信号特别强的肯定是高表达，阳性信号弱的肯定是低表达。还可通过RNA水平上RealTime PCR的试验结果估计一下，通常目的基因与内参基因Ct之差在10以内的比较容易获得阳性信号，10以上的会困难一些（当然这不是绝对的）。据说还可通过生物信息学分析现有数据库来判断的，本人没有使用过，估计也是利用RNA的表达数据吧。总之低峰度表达的蛋白，需要更多的蛋白上样量。4 总蛋白提取的基本步骤材料：冻存组织或新鲜组织（0.10.2g）、培养细胞（105107个）、Western及IP细胞裂解液（碧云天，货号：P0013）、超强RIPA裂解液（HaiGene，货号：C2501）、Benzonase核酸酶（HaiGene，货号：C2001）、PBS（HaiGene，货号：S0107）、PMSF(Amresco，货号：0754)。设备：离心机（Eppendof 5415D）、研钵4.1 细胞样品总蛋白的提取操作步骤（1）贴壁细胞PBS清洗3次后，用胰酶消化（通常每孔0.5ml），消化完毕后，加入0.5ml完全培养基终止消化，将细胞吹散，转入1.5ml EP管中。（2）如果你做的试验是与凋亡和信号通路有关的试验，要收集悬浮的死亡和凋亡细胞。细胞的培养上清液，于8000rmp离心5min，倒掉上清液，留底部细胞团块100l PBS重悬细胞，将该重悬液加入到步骤（1）的溶液中。（3）将步骤（1）中细胞或包含步骤（2）的细胞液，8000rmp离心5min后，倒掉上清，留底部细胞团块。（4）加入1ml PBS，不重悬底部细胞，只是冲洗一下EP管，再8000rmp离心2min。倒掉PBS，用移液器将剩余PBS吸取干净。（5）加入50l PBS重悬细胞，并将细胞吹打松散，加入150l超强RIPA裂解液和1l Benzonase核酸酶轻弹离心管室温放置30min。注意：如果是IP试验裂解液使用Western及IP细胞裂解液，并加入终浓度为1mM的PMSF蛋白酶抑制剂；超强RIPA裂解液中已经含有蛋白酶抑制剂通常无需再添加，对于研究蛋白包含磷酸化的情况来说，也可补加终浓度为1mM的PMSF蛋白酶抑制剂。（6）13000rpm离心10min，上清即为提取的细胞总蛋白，起始细胞量相差不多的情况下，通常这个蛋白样品不需要BCA定量。4.2组织样品总蛋白的提取操作步骤（1）先在1.5ml EP管中加入250l超强RIPA裂解液和1l Benzonase 核酸酶，待用。注意：如果是IP试验裂解液使用Western及IP细胞裂解液，并加入终浓度为1mM的PMSF蛋白酶抑制剂；超强RIPA裂解液中已经含有蛋白酶抑制剂通常无需再添加，对于研究蛋白包含磷酸化的情况来说，也可补加终浓度为1mM的PMSF蛋白酶抑制剂。（2）在液氮条件下将0.10.2g组织研磨致粉末状，将研磨好的组织加入到（1）的裂解液中，混合均匀，室温裂解30min。注意：由于研钵体会残留一些组织样品，对于组织过少的样品，可将组织研磨完毕后，轻敲打研钵体将组织沉淀于研钵体中，等待研钵温度升高后（防止结冰），将裂解液直接加入到研钵体中，进行裂解。（3）裂解完毕后，将样品13000rpm离心10min，上清即为提取的组织总蛋白。再进行BCA定量处理。二、总蛋白BCA定量有的同学认为对总蛋白进行BCA定量的必要性不大，这个问题我不做否认。毕竟总蛋白进行BCA定量调平后，内参蛋白还是会存在不一致的情况。但进行了BCA蛋白定量后，起码会给出一个样品用量的基本参考数据。这对组织样品来说尤为重要，这会减少内参的杂交次数，节约内参抗体的用量，因此组织样品还是建议进行BCA定量，细胞样品可以不做。如果你任性，愿意多杂交几次内参，不进行BCA定量，OK也没有问题。材料：提取的总蛋白样品、BCA蛋白质定量试剂盒（HaiGene，货号：C3001）、ELISA板（国产）。设备：恒温培养箱（上海一恒，LRH-250F）、酶标仪（北京六一，WD-9417B）操作步骤：（1）按照说明书用超强RIPA裂解液将标准品BSA稀释至2000、1500、1000、750、500、250、125、25、0g/l（其中0g/l作为归零样品）。（2）按照说明书将BCA-A和B液按体积比50:1混匀（3ml5ml），待用。（3）每孔ELISA板中加入200l AB混合液，将标准品和样品25l，分别加入到混合液中，混合均匀。（4）放置到培养箱中，37孵育30min，然后室温静置10min。（5）562nm处检测吸光度，并绘制标准曲线，根据公式计算出样品蛋白浓度。如测出的样品OD5620.8（即y0.8），则对应的X值（样品蛋白浓度）(0.8-0.1214)/0.0003=2262g/ml （即2.3g/l）。该图来源于说明书。三、SDS-PAGE凝胶电泳50KD以下的蛋白使用15浓度SDS-PAGE凝胶；50120KD使用10；120400KD使用6。由于我们没有梯度胶，蛋白分子量有跨度的就分开跑吧。材料、设备：SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天，货号：P0012A）、制胶架玻璃板（天能）、稳压电源（天能，EPS300）、电泳槽（天能，VE180）、1Tris-Glycine电泳缓冲液、5SDS-PAGE Loading Buffer（碧云天，P0015）。操作步骤：1 制胶不做过多解释了，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒参考说明书，先灌制分离胶，再灌制浓缩胶。该图来源于说明书。2 上样、电泳（1）根据BCA蛋白的定量结果，取出部分蛋白样品（50l）用超强RIPA裂解液稀释到相同的浓度，如蛋白定量结果为1.98g/l，2.5g/l，2.3g/l，可将蛋白统一定量到1.98g/l，即分别加入0l，13l，8l超强RIPA裂解液，再分别加入12.5l，15.8l，14.5l 5SDS-PAGE Loading Buffer即成为待上样电泳样品。（2）每孔上样1040l样品，浓缩胶使用100V电压进行电泳，进入分离胶以后可提高电压至150V进行电泳。电泳结束后进行转膜。四、转膜有些同学在杂交失败后都会寻找是不是转膜出了问题。其实这个步骤几乎不会出问题。而且这个步骤可以肉眼观察到是不是出了问题。试验的过程中因为使用了预染蛋白marker或预染发光Western Marker120（关于这两个marker的选择问题，稍后解释），转膜成功与否一目了然。实践证明湿转20min便足以将120kDa以内的蛋白转膜完成，而通常我们要求转膜1h，过长的时间不推荐（发热会导致蛋白结构发生变化）。再一个问题是关于膜的选择，很多人纠结于PVDF膜和NC膜到底哪一种更好，我的经验来看，两种膜试验结果没有明显差别。PVDF膜使用起来相对麻烦，而且ECL显色背景要高一些。最好还是用0.2m的NC膜，有愿意用PVDF膜的也不阻止，都没有问题。材料、设备：NC膜（PALL，货号：66485），转膜电泳槽（天能，VE 186），滤纸（国产），1Tris-Glycine转膜液。操作方法：（1）提前将裁切好的NC膜、滤纸和海绵pad浸泡于转膜液中，浸泡25min就够了。（2）转膜夹黑色面（负极）在下面依次铺上海绵pad、两层滤纸、凝胶、NC膜、两层滤纸、海绵pad，夹住就ok了。注意不要有气泡，有气泡的话可用玻璃棒赶出去。（3）放到转膜槽里面，100mA恒流1h。（4）转膜完毕后，看看膜上的预染蛋白Marker条带是否清晰（胶上是否还残留有Marker），清晰的话转膜就没有问题了。五、信号增强剂处理膜使用Western信号增强剂处理膜，不是必需的。对抗原含量低、抗体亲和力差的试验，可使用该试剂，来提高抗体的检测灵敏度、改善杂交效果。通常将信号提高35倍是没有问题的。而且使用该试剂可节省一半的一抗用量，如果你的抗原含量低、抗体亲和力差、抗体少且贵，可以用这个处理一下，步骤中要增加1015min。对于内参、VEGF等经常杂交的试验来说没有必要使用该增强剂。材料、设备：Western信号增强剂（HaiGene，货号：M2501）、脱色摇床操作方法：（1）转膜完毕后，ddH2O洗涤一次。（2）倒入10ml Western信号增强剂脱色摇床上孵育10min，倒掉增强剂后，直接进行后续封闭程序。六、封闭、一抗孵育、二抗孵育1 封闭关于封闭无非三个问题：选用何种封闭剂、封闭时间、封闭温度。对于封闭剂通常有BSA、脱脂奶粉、Casein、商业化的封闭剂，其中BSA、脱脂奶粉是用的最多的。Casein、商业化的封闭剂本人也用过，Casein很难溶解，溶解后也成浑浊样，封闭效果还可以，不过容易形成膜上背景斑点，商业化的封闭剂种类多，我用过Peirce的一种，效果感觉没有奶粉好。原理上来讲，不同的封闭剂对抗体可能会存在差别，但个人实践来看奶粉的效果还是最好的。个人建议5脱脂奶粉溶解于1TBST中，室温封闭1h，或4过夜。如果后续杂交不好再考虑5BSA溶解于1TBST中，室温封闭2h，或4过夜。封闭时间过长或封闭剂的浓度过高都会降低检测灵敏度，因此信号杂交弱的时候，可考虑将封闭剂的使用浓度降低12倍。2 一抗孵育一抗的孵育是Western Blot过程中最为关键的部分，大多数优化条件都在这个步骤中调整。影响一抗结合抗原的因素比较多，大体包括：封闭剂种类、孵育温度和时间、一抗使用浓度、一抗质量（关于一抗的厂家选择稍后介绍）。首次预试验可采用BSA一抗孵育液进行杂交，也可使用Western一抗稀释液（碧云天，P0023A或HaiGene，M3001），一抗使用供应商推荐浓度，4过夜孵育。杂交效果不理想，根据情况按照以下步骤进行优化再调整。情况一，无背景、无目的信号或太弱使用Western信号增强剂封闭时间改为室温1h增加4倍一抗用量仍然无背景、无目的信号或太弱仍然无背景、无目的信号或太弱考虑样品中是否有该抗原表达或太低？联系抗体供应商，是否该批次抗体有问题？实例：A: B:Fig A: 无背景，无目的信号Fig B: 无背景，有目的信号泳道M: 预染发光Western Marker 120 (Haigene，C0301)泳道1: 约36KDa目的蛋白 M 1 M 1 说明：Fig A: 5脱脂奶粉4封闭过夜，1:1000比例稀释一抗，4过夜孵育，二抗比例1:20000，Super ECL发光液发光检测信号。只检测到发光Western Marker 120，无目的带。Fig B: 将膜用Western一抗二抗去除液孵育15min，水洗三次5min，Western信号增强剂孵育10min，2脱脂奶粉室温封闭1h，1:400比例稀释一抗，4过夜孵育。可检测出目的带。情况二，高背景，但目的信号强封闭剂改为5脱脂奶粉，4过夜一抗孵育时间改为室温1h仍然高背景，但目的信号强一抗降低用量至1/4倍一抗孵育溶液改为1脱脂奶粉实例：C: D:Fig C: 高背景，目的信号强Fig D: 低背景，目的信号强泳道M: 预染发光Western Marker120 (Haigene，C0301)泳道1: 约62KDa目的蛋白 M 1 M 1说明：Fig C:5脱脂奶粉室温封闭1h，1:1000比例稀释一抗，4过夜孵育，二抗比例1:20000，Super ECL发光液发光检测信号。检测到高背景及强目的信号。Fig D: 将膜用Western一抗二抗去除液孵育15min，水洗三次5min，5脱脂奶粉4封闭过夜，用1脱脂奶粉以1:4000比例稀释一抗，室温孵育1h。背景得到改善。情况三，高背景，无目的信号或太弱封闭剂改为5脱脂奶粉，4过夜使用Western信号增强剂此时通常可解决背景问题，信号仍然弱或没有则再做调整增加4倍一抗用量封闭剂改为2.5脱脂奶粉，室温1h一抗孵育溶液改为1脱脂奶粉，4过夜信号仍然弱或没有考虑样品中是否有该抗原表达或太低？联系抗体供应商，是否该批次抗体有问题？实例：E: F:Fig E: 高背景，无信号Fig F: 背景与目的信号有所改善泳道M: 预染发光Western Marker120 (Haigene，C0301)泳道1: 约30KDa目的蛋白 M 1 M 1 说明：Fig E: 5脱脂奶粉室温封闭1h，1:1000比例稀释一抗，4过夜孵育，二抗比例1:20000，Super ECL检测信号。检测到高背景，无信号。Fig F: 将膜用Western一抗二抗去除液孵育15min，水洗三次5min，Western信号增强剂孵育10min，5脱脂奶粉4封闭过夜，一抗孵育溶液改为1脱脂奶粉，一抗比例1:250，4过夜，背景及目的信号都有所改善。3 二抗孵育二抗孵育比较简单，通常不会出问题（要搞清楚一抗来源，用正确的二抗类型），只要试剂不过期、或反复冻融、保存不当，这一步骤通常没有太多要注意的地方。我们试验过程中要求使用预染发光Western Marker120（HaiGene，货号：C0301），其中之一的目的，就是检测一抗、二抗孵育的过程中有没有问题，如果二抗有问题，这个Marker的发光条带是不发光的（预染条带可正常观察），说明二抗已经坏掉了，优化条件的过程中，就不要再做其它浪费时间的摸索了，否则你的二抗坏掉了，你都不知道，再做调整也是徒劳的。这个Marker由于可以和目的蛋白一起曝光出来，也很便于判断你的目的条带，不用再费劲的跟预染Marker拼接组合。二抗的供应商可选择金斯瑞、Santa，其使用比例通常在1：2000050000，用量多少通常不影响试验结果。材料、设备：1TBST（含1 or 2.5 or 5脱脂奶粉or 5BSA），1TBST，Western一抗稀释液（碧云天，P0023A或HaiGene，M3001），Western二抗稀释液（碧云天，P0023D或HaiGene，M3101），Western信号增强剂（HaiGene，货号：M2501）、BSA（Sigma，货号：A3912）、脱脂奶粉（超市购）、二抗（金斯瑞或Santa，种类比较多，详细看后面试剂列表）、超敏ECL化学发光液（HaiGene，货号：M2301）、胶片（柯达）、脱色摇床、暗室、LAS4000(GE)。完整的操作步骤：（1）转膜完毕后，20ml ddH2O洗涤膜一次，倒掉ddH2O。（2）倒入10ml Western信号增强剂脱色摇床上孵育10min，倒掉增强剂。（3）将膜放入20ml 1TBST含5脱脂奶粉（或2.5%浓度，或5%BSA），4封闭过夜（或室温1h）。（4）20ml 1TBST洗涤3次（5）将膜放入含一抗的Western一抗稀释液中（或1脱脂奶粉），4孵育过夜（或室温1h）。（6）20ml 1TBST洗涤3次（7）将膜放入含二抗的Western二抗稀释液中（或1脱脂奶粉），室温1h。（8）20ml 1TBST洗涤3次（9）20ml ddH2O洗涤1次（10）等量混合Super ECL A和B，将混合液加到膜上（通常2ml就够了，最多配4ml），室温放置2min，用镊子夹住膜的一个角，让膜上的ECL发光液流淌干净，可让一个角搭在卫生纸上面吸干。进行压片子或扫描。七、曝光显色目前我们组内全部是ECL化学发光显色，由于现在用的ECL是超敏的，哪怕是蛋白表达峰度低一点也可检测到。它比普通ECL灵敏度要高，当然比DAB的更要高了（有同学问过我这个问题）。目前我们有LAS4000扫描仪，用这个机器扫描比较简单，大部分试验可使用这个机器进行扫描。如果检测不到信号，那就用胶片试试，毕竟胶片的灵敏度还是要高于机器的灵敏度。机器扫描我就不做过多解释了，开机预热、选定扫描时间、start就行了。我说一下曝片吧，由于有了LAS4000后曝片少了，很多注意点会被慢慢遗忘。（1）Super ECL加完后，膜上残留一定不要太多。（2）膜最好放到一次性封口袋中，曝光夹里面的透明塑料膜要擦干净，防止ECL猝灭。（3）在暗室操作拿取胶片都要关掉红灯。（4）因为膜上有发光Marker条带，在暗室中可以看到亮的Marker条带，知道位置在哪里后，将胶片快速放上后，盖上夹子，不要再移动胶片，防止重影。取出胶片时动作也要快，防止重影。（5）胶片的压取时间，要根据目的条带来判断。如能肉眼看到目的条带，则5s就够了。肉眼看不到的话，第一张片子压1min，第二张压5min，第三张压30min。不要担心不发光了，Super ECL能持续发光1h。（6）显影液、定影液要新鲜配制（3天必须更换，配方见后面溶液配制），超过3天效果不好，片子发黑，不是漂亮的蓝色。胶片放显影液中3min就足够了，超过这个时间胶片容易发黑。从显影液里面拿出胶片后可以直接扔到定影液里面（不需要用ddH2O洗涤），定影5min就可以了，期间都不要开红灯，否则容易导致胶片发黑。八、灰度分析灰度分析是Western Blot试验的最后处理步骤，结果非常明显的不需要提供该项处理结果，仅仅将图片罗列一下就可以了，结果不是太明显的可以提供一下该分析结果。处理软件可使用Quantity One软件，选定灰度区域，获得灰度值。将目的条带的灰度与内参灰度进行比较，从而获得原始表达量灰度，再将原始表达量灰度值与原始表达量灰度值均值进行比较，从而获得在1上下浮动的最终表达量情况比较值（磷酸化蛋白的分析要使用磷酸化蛋白比上非磷酸化蛋白，分析方法相同）。实例分析如下：Quantit