运动对心肌细胞中凋亡调控基因的影响.doc

运动对心肌细胞中凋亡调控基因的影响张钧1，2，许豪文3 （1.扬州大学体育学院 江苏扬州 225002； 2.华东师范大学 上海 200062）摘要：目的：研究运动对心肌细胞中调控基因Bcl-2、Bax和p53的影响以探讨凋亡调控基因对运动引起心肌细胞凋亡的作用。方法：以大鼠中等运动强度训练、一次性力竭运动和过度训练为运动模型，采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术观察了大鼠心肌细胞中调控基因Bcl-2、Bax和p53 mRNA的表达。结果：长期中等强度的运动可造成大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2 mRNA表达明显增加，可抑制心肌细胞凋亡；而力竭运动和过度训练可引起心肌细胞中Bcl-2 mRNA表达下降和调控基因Bax、p53 mRNA表达显著升高以及凋亡调控基因Bcl-2/Bax比值显著下降，可促进心肌细胞凋亡。结论：心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2、Bax和p53在不同运动后的不同表达对心肌细胞凋亡的发生有明显的调控作用。关键词：运动；心肌；凋亡调控基因；Effects of exercise on apoptotic gene in myocardiumZHANG Jun, et al.(Yangzhou University, Yangzhou, 225002, China)Abstract: Objective: To probe effects of exercise on apoptotic gene Bcl-2, Bax, p53 in myocardium to study the regulating mechanism of apoptotic gene Bcl-2, Bax, p53 to myocardial apoptosis by exercise. Method: Using the model of moderate intensity swimming, once exhaustive exercise and overload training, the present study researches into the expression of different exercise model on apoptotic gene in myocardium by RT-PCR. Results: Expression of apoptotic gene Bcl-2 mRNA has increased after the moderate intensity exercise. It can inhibit myocardial apoptosis. Expression of apoptotic gene Bcl-2 mRNA has decreased, expression of apoptotic gene Bax and p53 mRNA have increased, but the radio of Bcl-2/Bax has decreased significantly after overload training and once exhaustive exercise. It can cause myocardial apoptosis. Conclusion: Different expression of apoptotic gene Bcl-2, Bax, p53 mRNA in myocardial after different exercise has significant regulated to myocardial apoptosis.Key words: exercise; myocardium; apoptotic gene;细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自我消亡过程。调控细胞凋亡的基因从功能上分为诱导细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。其中Bcl-2家族成员在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用1。p53基因作为“基因组的卫士”能通过加强促凋亡基因的转录，阻断抑制凋亡基因的转录而使细胞凋亡2。过度运动可造成心肌细胞凋亡的事实已得到证实3，而有关运动对心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2、Bax和p53的影响，国内外尚没有较全面的报道。本实验试图研究运动对心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2、Bax和p53的影响，以探讨凋亡调控基因对运动引起心肌细胞凋亡的作用。为进一步研究运动性疲劳的机制提供理论依据。1 材料与方法1.1实验动物： 选用雄性SD大鼠100只，由上海医科大学实验动物中心提供，体重100130g，常规分笼喂养，自然光照，饲养环境温度234，自由饮水进食。1.2分组和训练方案： 大鼠购进后，先适应性喂养2天，称重后，随机分为4组：（1）对照组（C）20只，常规饲养，不加干预。（2）中等强度训练组（MS）20只，进行中等强度游泳训练。游泳池为100cm70cm60cm长方体，水深50cm，水温331。大鼠每周训练6天，每天游泳训练1次，第一天下水游泳10min，以后逐日增加，第1周末时每天游泳30min，第2周末时每天游泳60min。此后维持这一运动量直至游满8周。（3）力竭运动组（ES）20只，常规饲养，满8周后，让大鼠做一次性力竭运动，力竭判断标准按Thomas报道文献4。（4）过度训练组（O）40只，参见朱全的方法建立大鼠过度训练模型5。1.3 PCR引物设计 Bcl-2、Bax、P53根据已发表的文献设计，引物1、引物2均来源于外显子2，由中国科学院上海生物化学研究所合成并由中国科学院上海生理所黄诚博士惠赠。1.4 实验方法1.4.1 样本采集 各组大鼠断头处死后，迅速取出心脏洗尽残血，取心室肌。对照组也以同样方法收集标本。1.4.2 大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax、p53基因mRNA的测定1.4.2.1大鼠心肌组织样品总RNA的制备 总RNA抽提采用异硫氰酸胍一步法（Chomczynski and Sacchi,1987）抽提总RNA6。RNA置20保存。1.4.2.2 总RNA的鉴定和定量 取1ul总RNA加入4ul样本缓冲液、1ulEB后于65变性10分钟，置冰浴10分钟后，在1的琼脂糖凝胶（含18的甲醛），于45电泳4小时，观察拍照，以判断RNA是否降解。取1ul总RNA溶解于99ul双蒸水中，混匀，紫外分光光度计测260/280nm比值，总RNA量(ug)=OD26040(ug/ul)。1.4.2.3 反转录反应 反转录反应按照美国Promega公司反转录反应体系测试试剂盒进行。生成cDNA。1.4.2.4 PCR扩增（总体积10ul） 10ulPCR反应体系中含50mM Tris-HCl, 1.5mM MgCl2, 4uM dNTPs, 10pM特异引物（见表1），0.05Uci a-32P-dATP, 0.1Utaq酶(PE)，0.4ul反转录产物cDNA，加入一滴石蜡油后于95预变性5分钟；94，2min；55，15min；72，3min；72延伸5min，得到扩增的基因片段。1.4.2.5 6%聚丙烯酰胺凝胶制备及电泳 制备6%聚丙烯酰胺凝胶，迅速混匀，灌入制胶板中，室温放置1h以上，点样，以40W恒功率电泳2h，停电泳，取出胶板，在干胶机上80真空抽干40min，胶干后，压X光片，于70放射自显影，然后扫描。1.4.3 结果计算 以GADPH的表达量作为标准，用Bcl-2、Bax、p53的表达量和GADPH的表达量的比值作为Bcl-2、Bax、p53表达量。1.5 统计学方法 所有数据以均数标准差（XS）表示，组间用t检验进行显著性分析。2 结果28S18S2.1 总RNA抽提结果 用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步抽提的心肌组织RNA经紫外光分光光度计检测显示，260/280nm比值介于1.82.0之间，10ul总RNA电泳鉴定见图1，28S荧光亮度约为18S的1倍，无其他大分子条带，表明总RNA无蛋白污染，无降解。 C MS ES O图1：总RNA电泳鉴定图2.2 运动对大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2mRNA表达的影响(见表1和图2)中等强度运动组大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2 mRNA表达最高，显著高于对照组、过度训练组和一次性力竭运动组大鼠(P0.05)。说明长期中等强度的运动可造成大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2 mRNA表达的明显增加。而超负荷运动可引起心肌细胞中Bcl-2 mRNA表达有下降的趋势。C MS ES O Bcl-2GAPDH图2：运动对大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2 mRNA表达的影响2.3 运动对大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bax mRNA表达的影响(见表1和图3)Bax一次性力竭运动组和过度训练组大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bax mRNA表达显著升高，与对照组和中等强度运动组相比有显著性差异(P0.01)；而中等强度运动组Bax mRNA表达和对照组相比无显著性差异，一次性力竭运动组大鼠和过度训练组大鼠之间Bax mRNA表达也无显著性差异。说明力竭运动和过度训练可造成大鼠心肌细胞中GAPDH凋亡调控基因Bax mRNA表达的显著升高。 C MS ES O图3：运动对大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bax mRNA表达的影响2.4 运动对大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2/Bax比值的影响(见表1) 由表2可见，一次性力竭运动组和过度训练组大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2/Bax比值显著下降，与对照组和中等强度运动组相比有显著性差异(P0.01)；而中等强度运动组该比值虽有升高，但和对照组大鼠相比未见显著性差异；一次性力竭运动组和过度训练组之间该比值也未见显著性差异。说明一次性力竭运动和过度训练均可造成大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2/Bax比值的显著下降。2.5 运动对大鼠心肌细胞中凋亡调控基因p53 mRNA表达的影响(见表2和图4)GAPDHp53 一次性力竭运动和过度训练组大鼠心肌细胞中p53mRNA表达显著升高，与对照组和中等强度运动组相比有显著性差异(P0.01)；而中等强度运动组大鼠p53mRNA表达和对照组相比无显著性差异，一次性力竭运动组大鼠和过度训练组大鼠之间p53 mRNA表达也无显著性差异。说明力竭运动和过度训练可造成大鼠心肌细胞中凋亡调控基因p53 mRNA表达的显著升高。C MS ES O 图4：运动对大鼠心肌细胞中凋亡调控基因p53 mRNA表达的影响表2：运动对大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2、Bax、P53 mRNA表达的影响（XS，N=6）组别(Groups) Bcl-2(Bcl-2/GAPDH) Bax(Bax/GAPDH) P53(P53/GADPH) Bcl-2/Bax对照组(C) 0.95590.0342 0.54110.0419 0.54740.0522 1.750.35中等强度组(MS) 1.00810.0385a 0.50810.0321 0.56700.0378 1.990.12力竭运动组(ES) 0.94470.0147b 1.65250.1229ab 0.99360.1340ab 0.570.21 ab过度训练组(O) 0.91450.0535b 1.78150.1147ab 1.12940.1171ab 0.540.46 ab注：a为和对照组相比(P0.01)； b为和中等强度训练组相比(P0.01)3 讨论 研究发现在细胞凋亡的过程中Bcl-2起着至关重要的作用，它们相互竞争形成同源或异源二聚体，通过调控线粒体变化，双向调节细胞凋亡，具有促进和抑制细胞凋亡的双重效应。其中Bcl-2基因具有抑制细胞凋亡的作用，而Bax基因则具有促进细胞凋亡的作用7。Bcl-2定位于线粒体外膜、内质网膜、核膜上，直接影响线粒体功能，阻止细胞凋亡一切早期征象发生，包括线粒体膜电位的下降，抑制PT孔开放，直接或间接阻止细胞色素C的释放，阻止细胞凋亡8。本实验结果表明，中等强度运动的大鼠心肌细胞中 Bcl-2 mRNA表达显著增加，而一次性力竭运动和过度训练的大鼠心肌细胞中Bcl-2 mRNA表达则有下降的趋势，中等运动强度运动的大鼠心肌细胞中Bcl-2的表达明显高于一次性力竭运动和过度训练的大鼠。有研究表明9，适宜的运动训练可使大鼠心肌细胞中Bcl-2蛋白表达增加，而长期大负荷的运动可使心肌细胞中Bcl-2蛋白表达下降。和本实验结果基本一致。说明适度的运动训练可促使心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2 mRNA表达的明显增加，可有效的防止心肌细胞凋亡；而长期超负荷运动则可引起心肌细胞中Bcl-2 mRNA表达下降，引起心肌细胞凋亡。力竭运动和过度训练使心肌细胞中Bcl-2表达下降，这样就不能有效的封闭PT孔，使一些小分子如细胞色素C等穿过线粒体膜，进入胞质，激活caspase级联反应，引起细胞凋亡。Bax的生物学作用是拮抗Bcl-2的保护作用而使细胞趋于凋亡。研究发现，Bcl-2/Bax异源二聚体的形成是调节细胞凋亡的一个非常重要的环节，通常Bcl-2和Bax的比值决定了细胞凋亡的发生与否，当该比值增加时抑制细胞凋亡；当该比值下降时则促进细胞凋亡。本实验结果表明，一次性力竭运动和过度训练可造成心肌细胞中Bax基因表达增加，而长期中等强度的运动不造成心肌细胞中Bax基因表达的增加。同时可见一次性力竭运动和过度训练的大鼠心肌细胞中Bcl-2/Bax明显下降，中等运动强度的大鼠心肌细胞中Bcl-2/Bax未见下降。说明一次性力竭运动和过度训练造成的心肌细胞凋亡增加和心肌细胞中Bax基因表达增加以及心肌细胞中Bcl-2/Bax下降密切相关。有关过度运动造成心肌细胞中Bax基因表达增加，促进心肌细胞凋亡的作用机制为：一方面Bax通过与Bcl-2相关蛋白形成异源二聚体，使其失去抑制细胞凋亡的活性。另一方面，Bax也独立地参与细胞凋亡的调控，可形成同源二聚体促进细胞凋亡10。本实验室以前的工作已证明超负荷运动可造成细胞色素C漏出线粒体进入胞浆，从而启动Caspase级联反应，引起心肌细胞凋亡11。p53基因作为“基因组的卫士”，在细胞损伤后修复及不可修复细胞的清除过程中发挥重要作用。Bcl-2与Bax等被认为是p53的靶基因。Miyashita发现p53可下调内源性Bcl-2的表达，上调Bax的表达，使Bcl-2/Bax比值降低，引起细胞凋亡12。本实验结果表明，一次性力竭运动和过度训练可造成心肌细胞中p53基因表达增加，而长期中等强度的运动不造成心肌细胞中p53基因表达的增加。其可能的机制为：力竭运动和过度训练造成心肌细胞缺血缺氧和钙超载13，引起心肌DNA的损伤。DNA的损伤可导致细胞中p53水平的迅速增高和作为转录因子的激活。心肌细胞缺氧和氧自由基亦可直接引起p53表达的增加14。增高的p53可介导心肌细胞凋亡，对心肌细胞凋亡进行调节。由此可见，力竭运动和过度训练引起的心肌细胞凋亡和该心肌细胞中p53表达增加密切相关。4 结论 心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2、Bax和p53在不同运动后的不同表达对心肌细胞凋亡的发生有明显的调控作用。参考文献：1Adams JM, Cory S. The Bcl-2 protein family: Arbiters of cell survivalJ. Science, 1998;281(5381):132213262Miyashita T, Krajewski S, Krajewski M, et al. Tumor suppressor P53 is a regulator of Bcl-2 and Bax gene expression in vitro and in vivoJ. Oncogene, 1994;9(6):179918053张钧，许豪文，杨小英. 运动对心肌细胞凋亡的影响J. 体育科学, 2002;22(5):92954Thomas DP, Marshall KI. Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structuresJ. Int J Sports Med. 1988;9(4):25760.5朱全,张敏. 游泳方法是建立大鼠模拟过度训练模型J. 中国运动医学杂志.1998;17(2);1371406Chomczynski P , Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol -chloroform extractionJ. Anal Biochem. 1987;162(1):156159.7Cosulich SG, Worrall V, Hedge PT, et al. Regulation of apoptosis by BH3 domains in a cell-free systemJ. Curre Biol, 1997;7(12):913