课程设计 2.doc

陕西理工课程设计课 程 设 计 题 目： 薯叶粉质量与安全综合分析评价 姓 名： 汪涛 班 级： 食 品101 指导教师： 韩豪 2013 年 11 月 目录1前言21实验目的和实验意义32 实验材料33实验主要试剂和仪器34实验方案34.1感官指标34.1.1色泽44.1.2气味44.1.3复水性34.1.4颗粒感34.2理化指标34.3安全指标45 实验方法45.1感官检验45.2理化检验45.3微生物检验46 实验具体操作步骤46.1薯叶粉的感官评价方法56.2理化指标具体检测方法5 6.2.1水分的测定56.2.2酸不溶性灰分的测定56.2.3粗蛋白质的测定66.2.4总酸的测定66.2.5粗纤维的测定66.2.6细度的测定76.2.7酸不溶性灰分的测定76.3安全指标的具体测定方法76.3.1菌落总数76.3.2大肠杆菌86.3.3霉菌和酵母86.3.4致病菌96.3.5总砷116.3.6铅117实验中可能存在的问题及注意事项127.1可能存在的问题127.2注意事项128文献12前言 红薯叶，即秋天红薯成熟后地上秧茎顶端的嫩叶。测试表明，每百克鲜红薯叶含蛋白质2.28克、脂肪0.2克、糖4.1克、矿物质钾16毫克、铁2.3毫克、磷34毫克、胡萝卜素6.42毫克、维生素C0.32毫克。将其与常见的蔬菜比较，矿物质与维生素的含量均属上乘，胡萝卜素含量甚至高过胡萝卜。因此，亚洲蔬菜研究中心已将红薯叶列为高营养蔬菜品种，称其为“蔬菜皇后”。研究发现，红薯叶有提高免疫力、止血、降糖、解毒、防治夜盲症等保健功能。经常食用有预防便秘、保护视力的作用，还能保持皮肤细腻、延缓衰老。近年在欧美、日本、香港等地掀起一股“红薯叶热”。用红薯叶制作的食品，甚至摆上了酒店、饭馆的餐桌。在我国，城市超市里见不到有红薯叶出售，农民收获红薯后将红薯叶，连同茎一起丢在地里，或用作喂牲畜的饲料，这是非常可惜的。在此我们优化薯叶粉的技术加工：新鲜薯叶筛选清洗干净薯叶杀青灭酶后薯叶冷却干燥控制温度和时间薯叶放于托盘包装薯叶干品薯叶粉成品粉碎（鲜薯叶、加工过程中及产品）通过对不同品种（品系）鲜薯叶各项理化指标的检测，完成不同品系薯叶组分和含量的测定，为开展下一步分析工作和产品初加工奠定理论基础；通过对产品加工工艺过程中各项理化指标的检测，确定最佳的工艺条件和工艺参数；通过对产品中各项理化指标的检测，制定产品质量评价标准。薯叶粉系列产品开发消费定位：硬胶囊，片剂，（依材料而定）五彩粉系列产品，为烘焙行业提供高级辅料， 将甘薯叶加工成甘薯叶粉，可作为食品添加剂和保健品辅料。从而产生很好的经济效益和社会效益；同时也为广大产薯区的经济发展提供一条新的致富途径。薯叶粉质量与安全综合分析与评价（汪涛）(陕西理工学院生物科学与工程学院食品专业101班，陕西 汉中 723000)指导老师：韩豪1实验目的和意义探讨薯叶粉的质量与安全，掌握其化学成分分析和营养学评价；为开拓薯叶粉系列产品奠定理论基础，确定消费定位满足市场对其做为食品添加剂，保健品和烘焙行业高级辅料的需求，从而产生很好的经济效益和社会效益；同时也为广大产薯区的经济发展提供一条新的致富途径。2实验材料 西蒙一号粉，由陕西杨凌金薯种业有限公司提供薯叶，尚属研发阶段，产品未上市。3实验试剂和仪器标品：去氢表雄酮，绿原酸，抗坏血酸，-胡萝卜素，葡萄糖。常规试剂：浓硫酸，无水乙醇，95%乙醇，NaNO2，Al (NO3 ) 3，NaOH，HCl，Zn粉，蒽酮，石油醚：沸程30 60 ，甲醇，2，4-二硝基苯肼，草酸，硫脲等。固体碘： 分析纯， 重庆品誉化工公司；无水氯化钙： 分析纯， 天津金汇太亚化学试剂有限公司。仪器：UV-2550型紫外-可见分光光度计：日本岛津仪器公司； 高效液相色谱仪 ：美国WATERS公司；BSA224S型电子分析天平： 赛多利斯科学仪器有限公司；101-1型电热鼓风干燥箱、HH-S4型恒温水浴锅 ：北京科伟永兴仪器有限公司；HN-2.5-10马佛炉：佛山市海纳仪器有限公司等。4实验方案4.1感官指标4.1.1色泽：均匀一致，呈鲜亮色，与原薯叶颜色非常接近。4.1.2气味：有薯叶特有的浓郁香气，无异味。4.1.3复水性：复水均匀，略有成团现象。4.1.4颗粒感：细腻润滑，无粗粒感。4.2理化指标 该样品理化指标检验项目严格按照国家标准要求进行检验，若在检验结果的范围以外为不合格，不得售出。表1薯叶粉理化指标项目指标薯叶粉水分，%10.0灰分（以干基计），%7.0粗蛋白质（以干基计，N6.25），%50酸不溶性灰分，%0.8总酸(以无水柠檬酸计)，%10酸价（以脂肪计），%4粗脂肪（以干基计），%2.0粗纤维（以干基计），%5.0细度（通过直径0.154mm筛），%954.3安全指标 该样品安全指标检验项目严格按照国家标准要求进行检验，若在检验结果的范围以外为不合格，不得售出。薯叶粉安全指标见表2薯叶粉安全指标项目指标薯叶粉菌落总数，（CPUg）30000大肠菌群，（MPN100g）90霉菌和酵母菌（CFUg）100致病菌（沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌）不得检出总砷(以As计)，0.5铅（以Pb计），1.0残留溶剂，5005实验方法5.1感官检验5.1.1抽样：按GBT 5009.1 执行。5.1.2色泽，气味的鉴定：按GBT 5492执行。5.2理化检验5.2.1水分：参考GB 5009.3-2010，直接干燥法。5.2.2酸不溶性灰分的测定：参考GB/T 8307-2002执行。5.2.3粗蛋白质的测定：参考GB/T 5009.5-2003执行。5.2.4总酸的测定：按照GB/T 12456-2008严格执行。5.2.5粗脂肪的测定：严格按照GB/T 5009.6-2003执行。5.2.6粗纤维的测定：严格按照GB/T 5009.6-2003执行。5.2.7细度的测定：参考GB 5009.42010，食品中灰分的测定。5.3安全检验5.3.1无机砷：按GB/T 5009.11 规定执行。5.3.2铅：按GB/T 5009.12规定执行。5.3.3黄曲霉毒素B1：按GB/T 5009.22规定执行。5.3.4菌落总数：按GB/T 4789.2规定执行。5.3.5大肠菌群：按GB/T 4789.3规定执行。5.3.6霉菌与酵母：按GB/T 4789.15规定执行。5.3.7沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄杆菌：分别按GB/T 4789.4，GB/T 4789.5，GB/T4789.10规定执行。6实验具体操作步骤6.1薯业粉的感官评价方法 打分法：分值范围110，取整数（优910，良68，中35，差12）。 该样品感官指标检验项目严格按照国家标准要求进行检验，若在检验结果的范围以外为不合格，不得售出。具体操作方法参考下表3：薯业粉品质感官检验量化打分表检验项目打分标准内涵诠释 1号 2号 3号 4号色泽优：非常接近良：比较接近中：不太接近差：很不接近鲜绿色气味优：浓郁香气良：香气较浓中：香气较淡差：无香气，有异味有薯叶粉特有的浓郁香气，无异味复水性优：复水均匀良：复水后略有成团中：复水后成团差：成团现象严重复水均匀，略有成团现象颗粒感优：细腻润滑良：粉粒感中：沙粒感差：粗粒感细腻润滑，无粗粒感总分6.2理化指标具体检测方法6.2.1水分的测定 参考GB 5009.3-2010，直接干燥法。取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于 101 105 干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热1.0 h，取出盖好，置干燥器内冷却 0.5 h，称量，并重复干燥至前后两次质量差不超过 2 mg，即为恒重。将混合均匀的试样迅速磨细至颗粒小于2 mm，不易研磨的样品应尽可能切碎，称取 2 g10 g试样（精确至0.0001 g），放入此称量瓶中，试样厚度不超过 5 mm，如为疏松试样，厚度不超过 10 mm，加盖，精密称量后，置 101 105 干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥 2 h4 h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5 h后称量。然后再放入 101 105 干燥箱中干燥 1 h左右，取出，放入干燥器内冷却 0.5 h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2 mg，即为恒重。 注：两次恒重值在最后计算中，取最后一次的称量值；在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5 %。6.2.2酸不溶性灰分的测定参考GB/T 8307-2002执行。用25mL10%盐酸溶液将总灰分分次洗人100mL烧杯中.盖上表面皿，在水浴上小心加热，至溶液由浑浊变为透明时，继续加热5min。趁热用无灰滤纸过滤，用热蒸馏水少量反复洗涤烧杯和滤纸上的残留物，至洗液不呈酸性为止(约150ml)。将滤纸连同残渣移人原柑竭内，在水浴上小心蒸去水分，移人高温炉内，以525士25C灼烧至无炭粒为止约1h)，待炉温降至300左右时，取出柑祸，于干燥器内冷却至室温，称景。再移人高温炉内灼烧30min，冷却并称量，重复此操作，直至连续两次称量差不超过0.001g为止，以最小称量为准。注：如果符合重复性检验的要求，取两次测定的算术平均值作为结果(保留小数点后两位)。同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.02g。6.2.3粗蛋白质的测定 参考GB/T 5009.5-2003执行。试样处理：称取充分混匀的固体试样0.2 g2 g、半固体试样 2 g5 g 或液体试样10 g25 g（约相当于30 mg40 mg 氮），精确至0.001 g，移入干燥的100 mL、250 mL 或500 mL 定氮瓶中，加入0.2 g 硫酸铜、6 g 硫酸钾及20 mL 硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5 h1 h。取下放冷，小心加入20 mL 水。放冷后，移入100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3 处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。 向接收瓶内加入10.0 mL 硼酸溶液及1 滴2 滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0 mL10.0 mL 试样处理液由小玻杯注入反应室，以10 mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0 mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2 份甲基红乙醇溶液与1 份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH 5.4；1 份甲基红乙醇溶液与5 份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH 5.1。同时作试剂空白。称取固体试样0.2 g2 g、半固体试样2 g5 g 或液体试样10 g25 g（约相当于30 mg40 mg 氮），精确至0.001 g。按照仪器说明书的要求进行检测。注：以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量1 g/100 g 时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量1 g/100 g 时，结果保留两位有效数字。6.2.4总酸的测定按照GB/T 12456-2008严格执行。将样品充分混合均匀，置于密闭玻璃容器内。总酸含量小于或等于4g/kg的试样将试样用快速滤纸过滤。收集滤液，用于测定。称取10g50g试样，精确至0.001g,置于100mL烧杯中。用约80煮沸过的水将烧杯中的内容物转移到250mL容量瓶中（总体积约150mL）。置于沸水浴中煮沸30min(振动23次，使试样中的有机酸全部溶解于溶液中)，取出，冷却至室温（约20），用煮沸过的水定容至250mL。用快速滤纸过滤。收集滤液，用于测定。称取25.000g50.000g试液，使之含0.035g0.070g酸，置于250mL三角瓶中。加40mL60mL水及0.2mL 1%酚酞指示剂用0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液（如样品酸度较低，可用0.01mol/L或0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液）滴定至微红色30s不退色。记录消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值（V1）。同一被测样品应测定两次。空白实验：用水代替试液。按上述步骤操作。记录消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值（V2）。 注：计算结果表示到小数点后两位。6.2.5粗脂肪的测定 严格按照GB/T 5009.6-2003执行，称取5g试样，精确至0.001g,同时按照GBT 5009.3 规定方法测定试样中含水率，转移到250ml的高脚杯中，加入100ml盐酸溶液和数粒玻璃细珠，盖上表面皿，在电热板加热到微沸，水解1h，每10min 摇动一次。水解液在室温下冷却，加两g硅藻土。用湿润的无脂双层中速滤纸过滤水解液，残渣至水洗至中性。将残渣带滤纸放入电热鼓风干燥箱中，在80鼓风干燥，烘干后，小心将含有残渣的双层滤纸放入提取套管中，在100电热古风干燥中干燥30min。取出套管并一小块脱脂棉覆盖。将提取套管放入索氏提取器的抽提管内，在已恒重的烧瓶中注入150ml的石油醚，并立即和抽提管相连接，至于水浴上回流抽取5h6h,控制每4min6min虹吸一次，抽提完后。取出滤纸包。待烧瓶中石油醚挥发尽后取下烧瓶擦干，在100干燥箱中烘1h2h，再在干燥器中冷却，称量，精确至0.0001g，重复以上操作直至前后两次质量差不超过0.0001g。6.2.6粗纤维的测定 严格按照GB/T 5009.6-2003规定执行。称取试样约2.5g (准确至。0.00 1g )于400m l一烧杯中，加人约100c 的1.25 %硫酸溶液，放在电炉加热(在1 min内煮沸)。准确微沸30 min并随时补加热水，以保持原溶液的体积。移去热源，将酸消化液倒人内铺50 km尼龙布(4.2)的布氏漏斗中，缓缓抽气减压过滤，并用每次50 ml沸蒸馏水洗涤残渣，直至中性，10 min内完成。用约 100ml的1.25%氢氧化钠200m，将尼龙布上的残渣全部洗人原烧杯中，放在电炉上加热(在1 min内煮沸)。准确微沸30 min，并随时补加热水，以保持原溶液的体积。将碱消化液连同残渣倒人连接抽滤瓶的玻质砂芯钳垠(4-3)中，缓缓抽气减压过滤，用50 ml，左右沸蒸馏水洗涤残渣，再用盐酸(5-3)洗涤一次，然后用沸蒸馏水洗涤数次，直至中性，最后用乙醇(5.4)洗涤二次，丙酮洗涤三次并抽滤至除去溶剂。将上述增竭及残留物移人干燥箱(4,5)中，120烘4h。放在干燥器(4-6)中冷却，称量(准确至0.001 g).将己称量的薯叶粉，放在高温炉中.525士25灰化2h ,待炉温降至300C 左右时，取出于干燥器中冷却，称量(精确至0. 001)。 注：如果符合重复性的要求，取两次测定的算术平均值作为结果，结果保留小数点后一位。同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.5g。6.2.6细度的测定 严格按照GBT 5507-2008执行。根据测定目的，选择符合要求的一定规格的筛子，用毛刷分别把每个筛子的筛娟上面，下面分别刷一遍，然后按大孔筛在下，最下层是筛底，最上层是筛盖的顺序安装。从混匀的样品中称取试样50.0g，放入上层筛，同时放入清理盘，盖好筛盖，按要求固定好筛子，定是10min,打开电源开关，验粉筛自动筛理。验粉筛停止后，用双手轻拍晒框的不同方位三次，取下各筛层，将每一筛层倾斜用毛刷把筛面上的残留物刷到表面皿中。 注：称量上层残留物时,低于0.1g时忽略不计；合并称量由测定目的所规定的残留物。6.3安全指标具体检测方法6.3.1菌落总数 严格按照GB 47892-2010执行。称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min，制成1:10 的样品匀液。 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。按以上操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15 mL20 mL 冷却至46 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养48 h2 h。水产品30 1 培养72 h3 h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按上述 条件进行培养。可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单（colony-forming units，CFU）表示。 选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 注：若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算；若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。6.3.2大肠菌群 严格按照GB 47893-2010执行。称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min，制成1:10 的样品匀液。样品匀液的pH 值应在6.57.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），361 培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.3.3霉菌和酵母 严格按GB/T 4789.15规定执行。按照固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。按操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。根据对样品污染状况的估计，选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。及时将15 mL20 mL 冷却至46 的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于461恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养5d，观察并记录。肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colonyforming units，CFU）表示。选取菌落数在10 CFU150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。注：计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算;若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算；若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。6.3.4致病菌 严格按照GB 4789-2005执行操作。以无菌操作取检样25 g（mL），加入装有灭菌225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8 000 r/min10 000 r/min 均质；或加入装有225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1 min2 min，液体样品振荡混匀即可。于41.5 ，厌氧培养16 h20 h。取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD 琼脂平板和MAC 琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36 1 培养20 h24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48 h 再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表10。表4 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板志贺氏菌的菌落特征MAC 琼脂无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘齐或不齐XLD 琼脂粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐志贺氏菌显色培养基按照显色培养基的说明进行判定自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36 1 培养20 h24 h，分别观察结果。凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其18.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。用已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13 型的鸟氨酸阳性另外由于福氏志贺氏菌6 型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表5。表5 志贺氏菌属四个群的生化特征生化反应A 群：痢疾志贺氏菌B 群：福氏志贺氏菌C 群：鲍氏志贺氏菌D 群：宋内氏志贺氏菌-半乳糖苷酶aa尿素赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶b水杨苷七叶苷靛基质/()/甘露醇c棉子糖甘油()()d注：+表示阳性；-表示阴性；-/+表示多数阴性；+/-表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性；d 表示有不同生化型。a 痢疾志贺1 型和鲍氏13 型为阳性。b 鲍氏13 型为鸟氨酸阳性。c 福氏4 型和6 型常见甘露醇阴性变种。附加生化实验由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 碱性-异型）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36 培养24 h48 h)。志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别见表6。表6 志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别生化反应A 群：痢疾志贺氏菌B 群：福氏志贺氏菌C 群：鲍氏志贺氏菌D 群：宋内氏志贺氏菌大肠埃希氏菌A-D 菌葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐dd粘液酸盐dd注1：+表示阳性；-表示阴性；d 表示有不同生化型。注2：在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱性-异型）菌至少有一项反应为阳性。如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据18.3.2的初步判断结果，用中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。严格按照GB/T4789.10。称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。将上述样品匀液于36 1 培养18 h24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 1 培养18 h24 h。Baird-Parker 平板36 1 培养18 h24 h 或45 h48 h。金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5m1m。血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 1 培养18 h24 h。取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置361 温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 1 培养18 h48 h，重复试验。 注：可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌肠毒素。6.3.5总砷 按GB/T 5009.11 规定执行。固体试样称样1g2.5g，置入50mL100mL锥形瓶中，同时做两份试剂空白。加硝酸20mL40mL，硫酸1.25mL，摇匀后放置过夜，置于电热板上加热消解。若消解液处理至10mL左右时仍有未分解物或色泽变深，取下放冷，补加硝酸5mL10mL，再消解至10mL左右观察，如此反复两三次，注意避免炭化。如仍不能消解完全，则加入高氯酸1mL2mL，继续加热至消解完全后，再持续蒸发至高氯酸的白烟散尽，硫酸的白烟开始冒出。冷却，加水25mL，再蒸发至冒硫酸白烟。冷却，用水将内容物转入25mL容量瓶或比色管中，加入50g/L硫脲溶液2.5mL，补水至刻度并摇匀，备测。一般应用于固体试样。称取1g2.5g（精确至小数点后第二位）于50mL100mL坩埚中，同时做两份试剂空白。加150g/L硝酸镁10mL混匀，低热蒸干，将氧化镁1g仔细覆盖在干渣上，于电炉上炭化至无黑烟，移入550高温炉灰化4h。取出放冷，小心加入（1+1）盐酸10mL以中和氧化镁并溶解灰分，转入25mL容量瓶或比色管中，向容量瓶或比色管中加入50g/L硫脲2.5mL，另用（1+9）硫酸分别涮洗坩埚后转出合并，直至25mL刻度，混匀备测。取25mL容量瓶或比色管6支，依次加入1g/mL砷使用标准液0、0.05、0.2、0.5、2.0、5.0mL(各相当于砷浓度0、2.0、8.0、20.0、80.0、200.0ng/mL)各加（1+9）硫酸12.5mL,50g/L硫脲2.5mL，补加水至刻度，混匀备测。光电倍增管电压：400V；砷空心阴极灯电流：35mA；原子化器：温度820850；高度7mm；氩气流速：载气600mL/min；测量方式：荧光强度或浓度直读，读数方式:峰面积；读数延迟时间：1s；读数时间：15s；硼氢化钠溶液加入时间：5s；标液或样液加入体积：2mL。如直接测荧光强度，则在开机并设定好仪器条件后，预热稳定约20min。按“B”键进入空白值测量状态，连续用标准系列的“0”管进样，待读书稳定后，按空档键记录下空白值即可开始测量。先依次测标准系列。标准系列测完后应仔细清洗进样器，并再用“0”管测试使读数基本回零后才能测试剂空白和试样，每测不同的试样前都应该清洗进样器，记录下测量数据。利用仪器提供的软件功能可进行浓度直读测定，为此在开机、设定条件和预热后，还需输入必要的参数，即：试样量（g或mL）；稀释体积（mL）；进样体积（mL）；结果的浓度单位；标准系列各点的重复测量次数；标准系列的点数（不计零点），及各点的浓度值。首先进入空白值测量状态，连续用标准系列的“0”管进样以获得稳定的空白值并执行自动扣底后，再依次测标准系列。在测样液前，需在进入空白值测量状态，先用标准系列“0”管测试使读数复原并稳定后，再用两个试剂空白各进样一次，让仪器取其均值作为扣底的空白值，随后即可依次测试样。测定完毕后退回主菜单，选择“打印报告”即可将测定结果打出。6.3.6铅 按GB/T 5009.12规定执行。在采样和制备过程中，应注意不使试样污染。试样消解（可根据实验室条件选用以下任何一种方法消解）。 压力消解罐消解法：称取1 g2 g 试样（精确到0.001 g，干样、含脂肪高的试样1 g, 鲜样2 g 或按压力消解罐使用说明书称取试样）于聚四氟乙烯内罐，加硝酸2 mL4 mL 浸泡过夜。再加过氧化氢2 mL3 mL（总量不能超过罐容积的1/3）。盖好内盖，旋紧不锈钢外套，放入恒温干燥箱，120