免疫组化步骤.doc

取组织：1. 心脏灌注将小鼠在肋弓下缘剪开，夹住胸骨角，向上翻开，暴露胸腹膜，从右向左剪开胸腹膜，暴露心脏，剪开右心耳（在心尖靠右一点）插入针管，先打入10ml水，再注入10%甲醛约10ml，（可重复一次），至肝脏发白，四肢有抽搐为成功。2. 取脑取脑后放入4%多聚甲醛中，固定保存24h3. 梯度脱水(不是必须步骤，但做的效果可能更好，但标本脱片是否与之有关系？)将脑放入5%蔗糖 48h-2.5%蔗糖 48h-1%蔗糖48h后放入4%多聚甲醛中，固定保存，制成切片。4. 自制蜡块三步法，sp试剂盒，需要摸浓度，还有PBS自己配免疫组化1. 常规石蜡切片，石蜡脱水60烤片30min脱蜡：二甲苯 5min 二甲苯 10min 无水乙醇95%酒精95%酒精80%酒精 各5sPBS液 洗3次，每次5min 2. 抗原修复枸橼酸盐 微波修复（冷却与小火之间） 13min 室温冷却至常温枸橼酸盐 微波修复（冷却与小火之间） 2 x 10min（10min后加少许冷枸橼酸） 室温冷却至常温（此步作为未作出时的办法，最大可以尝试到3x 10min）枸橼酸盐 微波修复（高火） 4 x 6min 室温冷却至常温（此步作为均未作出时的办法）3. 3%H2O2 10min（买30%的回来自己稀释） PBS液 洗3次，每次3min4. 封闭用正常山羊血清工作液 室温孵育20min5. 一抗 4过夜，第二天将过夜片放入37温箱孵育1hPBS液 洗3次，每次3min6. 生物素化二抗工作液37温箱孵育 30min PBS液 洗3次，每次3min7. 辣根酶标记链霉卵白素工作液37温箱孵育 30min PBS液 洗3次，每次3min8. DAB显色（此步最重要，一定要摸出最佳显色时间，要浪费三张片子，一张显过了，一张未显出来，一张介于二者之间）9. 自来水终止显色10. 苏木素染色2min，自来水冲洗（8次以上，不能怕麻烦），盐酸酒精分化，自来水冲洗（6次以上），PBS返蓝20min（PBS要预热15min）11. 脱水，透明（80%酒精95%酒精95%酒精无水乙醇二甲苯二甲苯各5秒，就是将脱蜡反过来了）12. 树胶封片（就滴很少，用手按压可以顺便将气泡压出，滴多了，树胶容易翻上盖玻片，那就麻烦了）注：95%酒精95%酒精二甲苯二甲苯都有卖的PBS自己配很划算（下页是配制方法）A液：0.1mol/L磷酸二氢钾：磷酸二氢钾（KH2PO4，MW136.09）1.361g，加双蒸水至100ml。B液：0.1mol/L磷酸氢二钠：酸酸氢二钠（Na2HPO4.2H2O，MW177.99）1.78g，加双蒸水至100ml。或者酸酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O，MW358.14）3.58g，加双蒸水至100ml。pH A液 （ml） B液（ml） 5.60 9.50 0.255.91 9.00 1.006.24 8.00 2.006.47 7.00 3.006.64 6.00 4.006.81 5.00 5.006.98 4.00 6.007.17 3.00 7.007.38 2.00 8.007.73 1.00 9.008.04 0.50 9.50一般免疫组化用PBS都只包含Na2HPO412H2O（磷酸氢二钠） NaH2PO42H2O（磷酸二氢钠）Nacl 用于细胞培养的PBS需含有氯化钾称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可0.01MPBS缓冲液 称取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO412H2O3.63g,KH2PO40.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。PBS是最普遍不过的实验室缓冲液，但其配方各异。以下是我的总结：母液的配制：0.2MNa2HPO4：称取71.6gNa2HPO4-12H2O，溶于1000ml水0.2MNaH2PO4：称取31.2gNaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配0.2MPB(pH=7.4，100ml)：取19ml0.2mol/L的NaH2PO4，81ml0.2mol/L的Na2HPO4,即可。然后只需将0.2MPB(pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，如：0.1MPB（PH=7.4）：取500ml0.2MPB，加水稀释至1000ml即可。0.01MPB（PH=7.4）：取50ml0.2MPB，加水稀释至1000ml即可。0.02MPB（PH=7.4）：取100ml0.2MPB，加水稀释至1000ml即可。若需要NaCL的话，加入NaCL至0.9%（g/100ml）即可。另：其它各种另PH值的0.2MPB（100ml)配方：pH0.2MNaH2PO4（ml）0.2MNa2HPO4（ml）5.793.56.55.89285.990106.087.712.36.185156.281.518.56.377.522.56.473.526.56.568.531.56.662.537.56.756.543.56.851496.945557.038627.133677.228727.323777.419ml81ml7.516847.613877.710.50.57.88.591.57.97938.05.394.7磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB），磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液配方磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）试剂： NaH2PO42H2O Na2HPO412H2O配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2O 31.2g(或 NaH2PO4H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：称取NaHPO4.12H2O 71.632g（或 Na2HPO47H2O 53.6g或 Na2HPO42H2O 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。（3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO412H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.47.5）。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.78.0）pH 0.2mol/L NaH2PO4(ml) 0.2mol/L Na2HPO4(ml)5.7 93.5 6.55.8 92.0 8.05.9 90.0 10.06.0 87.7 12.36.1 85.0 15.06.2 81.5 18.56.3 77.5 22.56.4 73.5 26.56.5 68.5 31.56.6 62.5 37.56.7 56.5 43.56.8 51.0