分析化学20_kwzs.pdf

一 电泳技术的创建者蒂塞利乌斯 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 1902 1971 瑞典生物化学家 1902 年 8 月 10 日生于斯德哥尔摩 1971 年 10 月 29 日卒于同地 他 4 岁时随家移居哥 德堡 1921 年入乌普萨拉大学 1924 年获化学 物理和数学三个硕士学位 1925 年师从物理化学家 T 斯韦德贝里 1930 年获博士学位 后任乌普萨拉大学化学 讲师 副教授 在此期间曾先后两次赴美国威斯康星大学和普林斯顿大学从事研 究和进修 1938 年任乌普萨拉大学教授 1950 年任生物化学研究所所长 1946 1950 年期间 任瑞典自然科学研究院主席 1951 1955 年任瑞典癌症学 术研究委员会主席 国际纯粹与应用化学联合会主席 他还是诺贝尔基金会付主 席 1947 年 主席 1960 年 1946 年以后一直任诺贝尔化学委员会委员 美国科学院海外院士 蒂塞利乌斯起 1925 年起从事胶体溶液中悬浮蛋白质的电泳分离研究 曾自 制超速离心机测定蛋白质分子的大小和形状 并与斯韦德贝里合作发表了第一篇 论文 报导了测定蛋白质淌度的新方法 1930 年他进一步改进实验手段和装置 发表了关于色谱法和吸附的论文 1935 年从美国回国后 重新改建原有电泳装 置 发展了区带电泳法 大大提高了效率和分辨率 1937 年他用自已设计的新电 泳装置成功地分离了血清中蛋白质的 4 个组分 分别命名为 白蛋白 和 球蛋白 该法迅速应用于分离和鉴定各种复杂蛋白质及其他天然物质的混合 物的组成 他因对电泳分析和吸附方法的研究 特别是发现了血清蛋白的组分而获得 1948 年诺贝尔化学奖 二 毛细管电泳新技术 1 芯片毛细管电泳和阵列毛细管电泳 常规毛细管电泳是指在内径 25 100 m 的石英毛细管中进行的电泳 毛 细管中填充了缓冲液或凝胶 所谓芯片毛细管电泳技术就是一项微型实验室技 术 又称集成毛细管电泳芯片 integrated capillary electrophoresis chips ICE 芯片 毛细管电泳芯片技术是指在芯片上蚀刻毛细管通道 将样品处理 进样 分离 检测均集成在一块几平方厘米的芯片上 在电渗流的作用下样品液在毛细 管通道中泳动 完成对样品的检测分析 芯片毛细管电泳法是 1983 年由 Dupont 公司的 Pace 开发 随后瑞士的 Ciba Geigy 公司和加拿大的 Alberta 大学合作利 用玻璃芯片毛细管电泳完成了对寡核苷酸的分离 毛细管阵列电泳 capillary array electrophoresis CAE 是在常规 CE 原理和 技术的基础上 结合微型制造技术设计出来的一种检测技术 它将平板凝胶电泳 和毛细管电泳两种方法的优点结合起来 在毛细管微阵列上并行地进行电泳 所 使用的 CE 芯片属通道型微阵列芯片 即由微通道或反应池等构成通道型微阵 列 通过加载生物样品 进行一种或连续多种反应 达到快速高效分析的目的 是一种新型的生物芯片 CAE 在高效快速的分离 高灵敏度的检测 灵活性的 设计和多功能单元的集成方面的潜力已逐渐显示出来 如将 PCR 反应器集成在 芯片上 可实现对 PCR 扩增的实时监测 也可以用于 DNA 点突变的检测 Woolley 等于 1994 年制成了首张毛细管电泳阵列芯片 在玻片上蚀刻了宽 30 70ttm 的毛细管阵列 上方再覆盖一层玻片形成封闭泳道 泳道内表面加入羟乙 基纤维基质 对 X174HaeIIIDNA 限制性内切酶片段进行了毛细管筛分电泳分析 首次用芯片毛细管阵列电泳检测 DNA 突变和对 DNA 进行测序工作的是由加利 福尼亚大学伯克利分校 Mathies 领导的研究小组完成的 通过在芯片上加上高压 直流电 他们在近 2 min 的时间内便完成了从 118 1353 bp 的多条 DNA 片段 的快速分离 2 毛细管电泳免疫分析 免疫分析是建立在抗原和相应抗体之间免疫结合反应的基础上 利用抗体 或抗原 作为选择性试剂测定抗原 半抗原 或抗体 的方法 毛细管电泳免疫分 析 Capillary electrophoresis based immunoassay CEIA 这一新技术将抗原抗体 的特异性识别反应 CE 的高效快速分离能力 与 LIF 的高灵敏度检测结合在一 起 利用抗原抗体复合物与游离抗原 抗体在电泳行为上的差异 将 CE 作为分 离与检测手段 这种联用技术的发展为 CE 开拓了一个新的应用领域 也为免疫 分析注入了新的活力 CEIA 具有样品用量少 测定速度快 易于自动化 可以 进行多组分同时分析等优点 随着高特异性抗体及其 Fab 和 Fab 片段的制备与 纯化等相关技术的成熟 它在临床 药物 环境分析等领域将发挥重要作用 三 毛细管电泳应用 毛细管的小孔径 高电阻 抗对流 大比表面积等特性使毛细管电泳可在高 电场 小电流下工作 实现高效 快速的分析 如今 CE 已象 GC 和 HPLC 一 样 通过多种模式在分析的各个领域成为重要分析手段 毛细管电泳的应用对象 首先集中于核酸 蛋白质和糖等生物大分子 但是 随着生物技术向医药卫生 农林牧渔 轻工食品 化工环境等领域的迅速渗透 其对象已越来越多地扩展到 各种较小的有机 无机分子和离子 包括在中药分析 制药等领域有特殊意义的 手性分子 1 在基因工程研究方面的应用 毛细管电泳是以生命科学为依托发展起来的一项新技术 CE 用于 DNA 分 析始于 1988 年 包括碱基 核苷 核苷酸 寡核苷酸 引物 探针 单链 DNA 和双链 DNA DNA 片断 PCR 产物 分析 通常用 CGE 或 MEKC 来进行基因的 分离分析 广泛用于基因突变 法医检验 遗传 临床诊断和 DNA 测序等研究 CE 与传统的平板凝胶电泳相比省时 省力且自动化 而高灵敏的安培检测器 LIF 检测器的使用 极大地拓展了这方面的应用 LIF 检测器可测定染色的 DNA 单个分子 在基因治疗和基因疾病诊断中需要进行 DNA 基因突变测定 运用 CE 进行 SSCP 单链构象多态性分析 RFLP 限制片断长度多态性分析 等方法都可 用于基因治疗 DNA 分析对刑事工作也提供了一种可靠的方法 从罪犯在现场 遗留的毛发 唾液及其他体液或组织中提取 DNA 样品 对某些基因进行 STR 或 RFLP 分析 然后与嫌疑犯 DNA 图谱进行比较 就有可能找到罪犯 这是传 统的血型或指纹分析不能比拟的 对规模浩大的人类基因组计划而言 毛细管阵 列电泳的使用将大大提高测序的速度 2 单细胞分析 对作为一个相对独立生物功能体的单细胞中的一些重要组分进行高效 灵敏 的检测 将有助于阐明一些重要的细胞生理过程 单个细胞的分析化学已成为分 析化学前沿领域的热门课题 CE 检测限低 分离效率高 已广泛用于单细胞多 组分定量检测 CE 在单细胞分析中的应用主要集中在神经科学领域 单细胞内 组分含量极低 发展高灵敏度检测器是关键 质谱检测器是能为亚微克级样品提 供结构信息的一种工具 通用性好 已有常压电离 API 快原子轰击 FAB 电 子喷雾等多种接口方式用于 CE MS 检测 进样器进一步微型化也至关重要 极 少量的取样对细胞损伤小 可测定单细胞中待测物的空间分布 进一步还能检测 细胞亚微结构功能体内的组分和进行细胞膜结构分析 如神经细胞内囊泡或突触 中神经递质的含量 另外随着分析对象的不断扩大 对分离的要求越来越高 寻 求多种分离模式 柱前预浓集或 CE 与其他分离手段联用将有效提高分离效率 实现单细胞中更多组分的分析 3 手性分离 手性药物的立体选择性差异已被证实 但长期以来多数手性药物以消旋体供 药 这显然会给临床治疗带来严重影响 因此手性对映体分离有巨大的实用价值 这本是 HPLC 的强项 但其耗费较大 需使用昂贵的特殊固定相并将大量手性 试剂加入流动相 而 CE 所使用的毛细管价格较低 使用溶剂只需要几毫升 手 性分离分为间接拆分和直接拆分 用 CE 直接拆分是发展方向 4 小分子离子分析 毛细管电泳在发展初期主要用于生物大分子的分离分析 但随着生物技术向 各领域的渗透 小分子离子的 CE 在 90 年代发展起来 无机离子可采用 UV 检 测 但许多离子在可见光区无明显吸收 因此电化学方法也被较多地用于无机离 子的测定 对阳离子分析 一般在缓冲溶液中加入络合剂来改变离子电泳迁移率 提高分离选择性并增加灵敏度 对阴离子分析要加入 CTAB 等阳离子表面活性剂 作为电渗流改性剂 使阴离子迁移方向与电渗流方向相同 且因电迁移速率不同 而得以分离 CE 还可用于元素形态分析 其在小分子离子分析方面的独到之处 已被广泛用于环境 地质及食品分析行业 5 其它方面 在生化分析方面 包括氨基酸 多肽 蛋白质 核酸的分析 是毛细管电泳 应用最有特色的一个方面 既可作为分离分析手段 同时也可作为产品纯度检验 的重要依据 如毛细管电泳可用于寡核苷酸 低聚肽 核苷 核苷酸 儿茶酚胺 半胱氨酸衍生物的分离 限制性内切酶 DNA 降解产物的毛细管电泳分析结果与 常规凝胶电泳完全吻合 而前者操作更简单 用时更短 此外 毛细管电泳还用 于纯化小分子寡核苷酸 检验其纯度 用于 DNA 顺序测定及 PCR 产物分析 体液内药物及代谢物的毛细管电泳分析同样具有其独到之处 对某些碱性药物毛 细管电泳比反相高效液相色谱分离效果更好 另外 所需样本少 不需复杂的预 处理过程 经济 不需昂贵的流动相 也为高效液相色谱所不能比拟 作为一种高 效分离技术 CE 在食品化工方面的应用也显示出巨大的潜力 分析的组分几乎 包含了除脂肪外