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116 SSR 引物开发方法概述 孟清照 李仕金 董转年 周 军 西南林学院资源学院 云南 昆明 650224 摘 要 SSR 标记因其丰富的多态性和共显性等优点 得以广泛应用 而应用该技术的前提是要有相应的 SSR 引物 文 章概述了引物的来源 并对其中的开发引物进行了重点叙述 在引物开发中对各种方法作了分析和比较 并提倡在开发大量引 物时使用磁珠富集法 关键词 SSR 引物开发 磁珠富集法 中图分类号 Q943 2 文献标识码 A 文章编号 1008 1151 2007 12 0116 02 SSR simple sequence repeat 又 称 微 卫 星 microsatellite MS 基序长 1 6bp 如 CA n AT n GGC n 等重复序列 广泛分布于各类真核生物基因组的 不同位置 而且分布比较均匀 平均每 10kb 的 DNA 序列中就 会出现一个微卫星序列 再加上 SSR 的重复次数不同和重复程 度不同 使其呈现高度的多态性 SSR 的两端有一段保守的 DNA 序列 根据这段序列可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引 物 对 SSR 进行 PCR 扩增 就可扩增出其长度多态性 即 SSR 分子标记 与以往的分子标记相比 SSR 标记具有共显性 高 度重复性 高度丰富的多态性等优点 成为构建遗传连锁图谱 研究群体遗传学 进行分子辅助育种 系谱分析 品种指纹图 谱绘制 品种纯度检测 目标性状分子标记筛选和法医鉴定的 理想工具 但使用 SSR 标记的前提是已知重复序列两侧的 DNA 序列和设计引物 因此 SSR 引物对 SSR 分子标记技术的应用至 关重要 在 SSR 引物的来源问题上 概括起来有以下四种途径 1 相关文献 2 近缘种的引物 3 数据库搜寻法 利用专门 的 SSR 分析软件 搜索 GenBank EMBLheDDBJ 等公共数据库中 的 DNA 序列和 EST 序列获得 SSR 序列 然后设计引物 4 根据 从所研究类群基因组文库中筛选出的一套 SSR 位点两翼序列 设计引物 其中 最方便 最经济的方法就是从已发表的文献中获得 微卫星引物 但该法在使用对象上 只限于已有引物开发出的 物种 而且引物的数量不会有所增加 只能停留在原有基础上 对于近缘种引物的应用 其适用范围究竟有多大 原物种的 SSR 基因座在其他物种间转移扩增时 其多态性如何 这些问 题使得在不同物种间共用 SSR 引物 盲目性较大 可指导操作 的理论依据不足 最好的途径就是通过后两种途径进行 SSR 引物的开发 一 数据库搜寻法 近年来随着数据库中 EST 序列的增加 通过数据库搜寻法 获得 EST SSR 的报道越来越多 如茶树 小麦 云杉 甘蔗 苜蓿等中已见报道 在此基础上进行 SSR 引物开发也就成了一 种既经济又有效的方法 其开发路线如下 第一步从美国国家生物技术信息中心 NCBI http www ncb i nlm nih gov entrez query fcgi 中搜索有 关物种的 EST 序列 第二步对大量的 EST 序列进行处理 利用 Clustal W 等程序 根据相似性程度 剔除冗余的 EST 再剔 除过短的序列 小于 100bp 和过长的序列 大于 700bp 第 三步利用 Repeatmasker 等软件结合人工搜索 获得含有 SSR 的 EST 第四步从获得的 EST SSR 中 选取合适的序列 利用 Primer primer5 0 进行引物设计 忻雅等通过对 4584 条白菜 EST 进行搜索 共检索出 474 个 SSR 检出率为 10 3 包括 40 种重复单元 设计了 15 对 EST SSR 引物 在合适的 PCR 体系下 以构建 EST 的白菜自交 系的 DNA 为模板 对设计的 EST SSR 引物进行筛选 发现 15 对引物都能扩增出产物 进一步用这些引物对 28 个白菜品种 进行 PCR 扩增 发现 7 对引物显示多态性 占引物总数的 46 7 结果表明根据 EST 开发 SSR 引物是一条简便而有效的 途径 该法的最大缺点是 只限于已有序列数据公布的物种 从 EST 中筛选的微卫星要比从基因组中筛选的微卫星多态性低 Eujayl发现小麦基因组微卫星多态性53 远高于其EST微卫星 多态性 25 二 从基因组文库开发 SSR 引物 SSR 引物尽管可以通过前 3 个途径获得 但对于大部分物 种而言 其数量有限 因此 最根本 有效的途径是通过构建 微卫星文库来开发本物种的 SSR 引物 通过基因组文库开发 SSR 引物的方法主要有经典方法 富集法和省略筛库法 1 经典方法 1 经典方法 经典方法首先制备基因组 DNA 建立基因组文库 然后用 含有 SSR 的探针与之杂交 筛选阳性克隆 测序 根据 SSR 两侧的 DNA 序列设计引物 它又包括两种方法 一是构建与筛 选大插入片段基因组文库方法 首先 筛选大插入片段基因组 文库 纯化出和探针有较强信号的克隆 分成亚克隆 然后再 次筛选含重复序列的克隆 其缺点是多次杂交筛选和难于测序 2007年12月刊 大 众 科 技 2007 12 总第 100 期 DA ZHONG KE JI Cumulatively No 100 收稿日期 2007 03 22 作者简介 孟清照 1978 女 江苏徐州人 西南林学院资源学院硕士生 主要从事林木遗传育种的学习和研究 117 相对大的亚克隆等 针对此缺点 人们想出了第二种方法 构 建与筛选小插入片段基因组文库方法 先把基因组 DNA 酶切成 200 1500bp 的小片段 或者用超声波把基因组 DNA 处理成为 200 600bp 的小片段 再用 Klenow 片段补平以构建小片段基 因组文库 其缺点是测序容易 但 SSR 阳性克隆的得率很低 植物中已报道的阳性克隆比率约为 2 3 成功获得引物的 机率则更低 Tokuko 等在研究东南亚热带雨林树种龙脑香科植物 Shorea curtisii 的时候 最初就是用这种方法 他们用 Sau3 Hae Alu 和 Rsa 所组成的限制性酶混合物去消化基 因组 DNA 获得 300 500bp 的小片段 并将它们连进 PUC18 载体 进而转化 E coli JM109 获得一个含小插入片段的基因 组文库 用 CA 15 和 CT 15 作探针与该文库杂交 从 6000 个克隆中获得 4 个阳性克隆 经测序后发现一个假阳性 一个 重复太短 一个序列不够长 最后只得到一个 SSR 引物对 Shc01 Callum 和 Joseph 研究拟南芥 Geoffrey 等人研究 Channel catfish 的时候 都曾用过此法开发 SSR 引物 虽然该法开发引物的效率很低 但操作简单 易掌握 在 现已获得的 SSR 标记中 四分之三以上的是利用经典方法开发 出的 2 富集法 2 富集法 鉴于经典方法开发引物的效率很低 发展了富集法 富集 法通过建立和筛选微卫星富集文库 提高 SSR 克隆的得率 它 又分为利用含 SSR 的 PCR 引物进行 PCR 富集 即引物法富集 和用含 SSR 的探针进行杂交富集 即杂交法富集 两种方法 1 引物法富集 引物法富集微卫星一般是指使用同目的微卫星重复互补 的寡核苷酸作为引物 通过 PCR 反应在文库构建前或构建后富 集微卫星位点 根据所使用引物类型的不同可分为两类 1 引物序列同微卫星寡核苷酸互补的富集法 Elaine 等以狗的基因组 DNA 为材料 采用传统方法先获 得一个小插入片段的初级基因组文库 然后以 5 磷酸化的核 苷酸 CA n 为引物进行一步 PCR 经连接 转化 获得一个 含 CA n 的标记选择库 即富集文库 随机挑取单克隆培 养后转膜 杂交 再次筛选 得到的结果是 40 50 都是强 烈阳性克隆 比起传统方法效率提高了 50 倍 2 简并性寡核苷酸引物富集法 1996 年 Fisher 等人发明的 5 锚定 PCR 技术 利用 5 锚定 SSR 引物对基因组 DNA 进行扩增 实验设计了 5 KKVRVRV CT 6 3 为简并引物 K 可以和任意的核苷酸配 对 V 不能与 A 配对 R 不能与 G 配对 其他核苷酸均可以和 它们配对 在 PCR 过程中 由于 VRVRV 不能与 GA 配对 该引 物与模板 DNA 结合的时候 就不会在 GA n 重复区滑动 从 而固定 SSR 引物增加了扩增的特异性 另一方面简并引物的多 样性为成功获得多基因座扩增产物提供了更大的可能性 在实 验中随机抽取 8 个阳性克隆测序 结果表明 各 SSR 相异 且 序列两侧均有 SSR 存在 重复数从 6 12 不等 2 杂交法富集微卫星 近 10 年来 被使用较多的引物开发策略是基于选择性杂 交的富集方法 具有代表性的是两种杂交方法 根据所使用的 介质不同分为尼龙膜法和磁珠富集法 1 尼龙膜法 通过吸附在尼龙膜上的许多微卫星探针来富集基因组中 的微卫星片段 洗脱结合片段 进行 PCR 扩增 连接载体转化 大肠杆菌 阳性克隆测序 应用尼龙膜法 Giovannim 用 11 个微卫星重复探针从 Saccharum spp 中筛选微卫星位点 富集效率提高了 40 D J Rowe 用 GA 10 探针对蜜蜂 Apismellifera 的基因组 克隆膜上进行杂交筛选 结果从12个阳性克隆中获得了18 条 微卫星序列 2 磁珠富集法 Kandpal 18 等提出的磁珠富集法 与杂交反应固定在尼 龙膜上的相比 由于探针处于液体介质中 杂交更充分 具有 高效富集微卫星 DNA 的作用 磁珠富集法的基本原理是首先用生物素标记重复序列特 异探针并与基因组 DNA 酶切片段杂交 再利用生物素与链亲和 素亲和性强的特性 用包被链亲和素的磁珠进行磁力吸附完成 重复序列目标片段的富集 经过磁珠富集后使克隆测序量大幅 下降且使获得具有重复序列的片段的效率大幅度提高 因此 成为 SSR 引物开发极其有效的方法而迅速得到广泛应用 Rosane 等在研究巴西濒危树种 Caryocar brasiliense 的 SSR 标记时 用到了微卫星磁珠富集法 基因组 DNA 酶切后 没有建立初级基因组文库 而是直接与生物素标记 AG CT n 探针杂交 然后用包裹有链亲和素的磁性小珠回收 SSR 片段 经连接 克隆后 直接获得微卫星富集文库 再用一个地高辛 标记的 AG n 探针杂交筛选 阳性克隆得率为 19 5 薛华柏等利用磁珠富集法开发中国李核微卫星 在随机挑 选的 36 个克隆进行菌落 PCR 检测时 从 31 个阳性克隆中挑选 18 个克隆进行测序后获得 12 条特异序列 设计了 8 对引物 并在受试品种上获得预期的扩增产物 沈富军等应用 Dynal 磁珠 生物素标记的微卫星探针与大 熊猫基因组酶切片段杂交 捕获 400 600bp 含有微卫星序列 的 DNA 片段 连接到 pGEM T 载体中 构建富集微卫星序列的 小片段插入文库 应用同位素标记的探针筛选文库 从 2880 个转化子中获得了 260 个阳性克隆 对 54 个序列进行了测序 并成功地设计了大熊猫微卫星引物 37 对 以往筛选微卫星的方法一般是在克隆前不进行富集或者 利用印迹杂交 放射自显影等技术达到富集的目的 这些方法 都存在明显的不足之处 前者要从大量的重组体中找到含量很 低的目的 DNA 片段 耗费时间长并且成功率低 后者操作过程 复杂繁琐另外对实验室的条件有很高的要求 磁珠富集法只要 通过几步简单的操作就能得到富含微卫星位点的 DNA 片段 减 低了实验成本 缩短了实验周期 且成功率高 我们提倡在开 发大量 SSR 引物时采用该法 3 省略筛库法 3 省略筛库法 省略筛库法包括几种多基因座 SSR 标记分离法 它们可以 提高有用 SSR 序列的得率 2001 年 Hayden 和 Sharp 在 5 锚 定 PCR 技术基础上发明的序列标签微卫星 sequence tagged microsatellite profiling STMP 和 选 择 扩 增 微 卫 星 selectively amplified microsatellite SAM 1 STMP STMP 是 5 锚定 PCR 与基因表达的系列分析 SAGE 两种 技术现结合的产物 其基本原理是应用 5 锚定 PCR 获得多个 基因座的 SSR 序列 包括一头侧翼序列 然后利用 SAGE 技术 将这些侧翼序列串联起来 再进行克隆 下转第 107 页 107 3 安装简单维护工作量小 安装简单维护工作量小 与采用测量动压的方法测量风 速相比 减少了引压管路 微差压变送器 以及防止传感器的 堵塞的吹扫系统 本系统只需从传感器往控制柜铺设电缆 工 作量小 而且不存在堵塞问题 维护简单 4 高抗磨传感器 高抗磨传感器 采用特殊航空耐磨材料制成的传感器 能够在正常工况下使用最少4年 而且更换简单方便 更换后 无须重新校对 5 全数字化智能调整 软件自动进行系统调试 无须人工干 预 全数字化智能调整 软件自动进行系统调试 无须人工干 预 由于采用全数字化设计技术 系统进行自动调试和诊断 6 接口功能完善 具备接口功能完善 具备 MODBUS RS485 HART 现场 总线等数据接口 同时具有模拟量信号输出功能 现场 总线等数据接口 同时具有模拟量信号输出功能 具备MIS 系统接口 可向MIS系统上传数据或直接将本机做为WEB 服务器 由WEB模块支持局域网的访问 四 实际用途 测定一次风管内煤粉的浓度 流速 判断各一次风管之间 煤粉的分布是否均衡 根据所测结果进行如下调整和诊断 1 调整缩孔挡板 能够把进入各燃烧器煤粉的质量流量调 整均匀 2 调整节流圈开度 保证锅炉同一层各一次风管至燃烧器 出口的阻力的热态平衡 3 调整燃烧器的风煤比 保证在不同负荷下的优化燃烧 同时减少NOx 锅炉锈蚀和降低飞灰含碳量 4 探测一次风管内的堵管 断粉及煤粉自流等现象 及时 发现故障 防止锅炉灭火 五 具体实施 1 数据采集 1 数据采集 DCS 系统通过模拟量从本系统采集数据 每根风管包含一 个风速和一个浓度 各占用 1 个点 风速量程为 0 60m s 浓 度量程为 0 100 2 画面组态 2 画面组态 画面通过数值和棒图来实时显示一次风管的风速和浓度 值 每层四个角的值对比显示 有利于运行人员的观察和调整 由于由 DCS 系统作上位组态 所以风粉系统画面与整个 DCS 的风格一致 可根据运行的需要 随意组合相关信息 达 到运行监视的需要 3 历史趋势显示 3 历史趋势显示 曲线画面显示风速 浓度的实时曲线及历史趋势可由 DCS 系统自带功能实现 4 DCS 报警判断逻辑 4 DCS 报警判断逻辑 在锅炉运行过程中 某一次风管的风速 V 该风管应处 于正常运行状态 如果此风管的风粉浓度 该风管可能出 粉不好 应立即进行处理 系统发断粉报警信号 报警参考值 V 20m s 10 在锅炉运行过程中 给煤机运行且该磨煤机出口闸板门在 开位 风速 V 则该风管可能有煤粉堆积 即将发生堵管故 障 系统发堵管报警信号 运行人员应立即处理 报警参考值 V 10m s 上述两个报警参数域值 V 的值应根据实际运行情况进 行设定和调整 六 结束语 微波风粉在线监测系统可以无接触测量和实时显示各一 次风风管内的煤粉浓度 一次风速 能够连续 稳定可靠 实 时地反映各个参数的在线特性 便于运行人员及时调整火焰状 态 避免火焰中心偏离 防止结焦 结渣 降低飞灰含碳量 保持锅炉经济安全运行 降低 CO 和 NOX 排放 减少对环境的 污染 通过在线数据进行燃烧系统优化调整 提高机组热效率 降低煤耗 另外 本工程没有采用技改的形式而是在建设期间通过设 计院设计 单独采购微波风粉测量系统的就地设备 然后有效 地和DCS系统相结合 高效地实现了DCS一体化监视煤粉浓度 一次风速的目的 值得新建机组鉴戒 参考文献 1 刘定平 火电厂中一次风煤粉浓度测量技术分析 广东电力 2 周菊华 黄生琪 梁军 浅议电站锅炉燃料与空气最佳配合曲 线 J 锅炉技术 上接第 117 页 测序 从而一次测序所获得的有用 SSR 的信 息量比传统方法增加了 25 倍 STMP 法虽然提高了开发 SSR 引 物的效率 但操作过程却很繁琐 2 SAM 相比之下 SAM 法的步骤要简单一些 它是 5 锚定 PCR 与 另 一 种 产 生 多 基 因 座 SSR 指 纹 图 谱 的 技 术 SAMPL Selectively Amplified Microsatellite Polymorphic Loci 相结合的产物 并在 SAMPL 的基础上加以改进发展而成 其具 体过程是 首先将两个特殊类型的接头分子连接到