二 培养基及其制备.ppt

第二章培养基及其制备 重点 培养基的原料 培养基的营养成分 发酵培养基的选择 淀粉水解糖的制备 难点 淀粉水解理论基础 生物合成的前体物质 第一节培养基的原材料一 培养基的营养成分及用途微生物的养料来源光光能自养氢 硫 氨自养菌 能源亚硝酸盐 亚铁盐化能自养碳水化合物等有机物石油天然气和石油化工产品异养菌功能 生长 繁殖需要 碳酸气淀粉水解糖 糖蜜 亚硫酸盐纸浆废液等石油 正构石蜡 天然气醋酸 甲醇 乙醇等石油化工产品功能 提供能量 构成菌体 代谢产物的物质基础 豆饼或蚕蛹水解液 味精废液 氮源玉米浆 酒糟水等有机氮尿素 硫酸铵 氨水 硝酸盐等无机氮 气态氮功能 构成菌体 含氮代谢物 碳源 磷酸盐 钾盐 钙盐等矿物盐 无机盐铁 锰 钴等微量元素功能 构成菌体 参与酶的组成 维持酶活性 调节渗透压 调节pH值 维持氧化还原电位 特殊生长因子 硫胺素 生物素 对氨基苯甲酸 肌醇等功能 酶的辅助部分 维持生命活动 水分功能 生化反应均在水溶液中进行 二 培养基的类型1 依营养物质的来源分类 天然培养基 麦芽汁 玉米粉 麸皮 锯末等 合成培养基 高氏培养基 察氏培养基等 半合成培养基 牛肉膏蛋白胨 土豆葡萄糖培养基 2 依培养基制成的形式分 液体培养基 固体培养基 3 依培养基主要成分和使用目的来分 基础培养基 完全培养基 鉴别培养基 pH指示剂 不同微生物颜色 选择培养基 如加抗生素 4 根据生产工艺来分 孢子培养基 种子培养基 发酵培养基附 培养基配方举例 肉汤培养基 1 成份 牛肉膏5克蛋白胨10克氯化钠5克2 制法 1 于1000毫升水中 加入上述成分 混合加热溶解 2 用1mol氢氧化钠矫正pH7 2 7 6 煮沸3 分钟 用滤纸滤过 补足失掉的水分 3 分装于烧瓶或试管中 瓶口或管口塞好棉塞包装后 高压蒸气灭菌 121 灭菌20分钟 4 灭菌后放于阴凉处 或放冷后存于冰箱中备用 土豆葡萄糖琼脂培养基 土豆500g葡萄糖20 0g琼脂20 0g称取500克土豆 去皮切成丁 立即加入1000ml水 充分煮沸 用棉布过滤 滤液用水定容至1000ml 再加入其它成分 高压灭菌 115 20分钟 三 发酵培养基的选择发酵培养基的用途与要求 成分 配比经实验确定 配制时兼顾原料来源 成本及工艺管理 工业上确定发酵培养基的方法 1 了解菌种的营养要求 2 了解菌种的培养条件 3 先进行小试验 摸索菌种对碳源和氮源的利用情况 四 原料转换及意义发酵培养基中所用原材料 大部分属于粮食 油脂 蛋白质和农用肥料 其中山芋粉 玉米粉 淀粉 糊精 麦芽糖等都是可供人畜食用的粮食 油料或以粮食为原料的产品 我国人口众多 发酵产品的品种和产量与日俱增 每年都要消耗大量粮食 油料和蛋白质原料 原则 以废代好 废糖蜜 农业废料等 以可再生代替不可再生 野生植物淀粉 纤维水解物 节约原料 使发酵稳定 高产 第二节淀粉水解糖的制备 多数微生物不能直接利用淀粉淀粉水解糖已应用于谷氨酸发酵等工业淀粉水解后的糖液主要是葡萄糖 少量二糖 低聚糖等提高出糖率 糖的质量 一 淀粉水解糖的制备方法1 酸解法 以酸为催化剂 高温高压转化优点 简单 设备少 时间短缺点 设备易腐蚀 要耐高温高压 有副反应 淀粉粒小 浓度不能太高 水解条件 第19页2 酶解法 淀粉酶 包括液化 淀粉酶 和糖化 糖化酶 两步水解条件 第20页 双酶水解法制葡萄糖的优点 1 淀粉水解是在酶的作用下进行的 酶解的反应条件比较温和 2 酶作用的专一性强 淀粉的水解副反应少 因而水解糖液纯度高 淀粉的转化率高 3 可在较高淀粉浓度下水解 40 比酸水解高一倍 4 由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶 糖液的营养物质较丰富 发酵培养基的组成可简化 5 用酶法制得的糖液颜色浅 较纯净 无苦味 质量高 有利于糖液的精制 双酶水解法制葡萄糖的缺点 时间长 2 3天 设备多 条件 适合酶水解 较多 过滤困难 3 酸酶结合法 酸酶法 先将淀粉酸水解为糊精或低聚糖 再用糖化酶水解为葡萄糖 应用 玉米 小麦等谷类淀粉 坚实 酶酸法 先用 淀粉酶液化 再用酸水解为葡萄糖 应用 碎米淀粉等 酸水解不均匀 不同糖化工艺所得糖化液质量比较 醛 二 淀粉酸水解理论基础淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生 水解反应 复合反应 分解反应 其中水解反应是主要的 在淀粉糖化过程中 这三种化学反应的关系如下 分解 水解 1 淀粉的水解反应及其影响因素淀粉 直链 a 1 4键缩合 支链 a 1 6键缩合 聚合度高 淀粉酶 又称为淀粉液化酶 只作用于淀粉 1 4葡萄糖苷健 其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精 淀粉 1 4 1 6葡萄糖苷酶 又称为糖化酶 可以水解淀粉分子的 1 4 或 1 6葡萄糖苷健 其作用特点是 淀粉的分子链越短水解速度越快 水解产物为葡萄糖 酸的种类 盐酸 硫酸 磷酸酸水解主要因素酸浓度 高利于水解 但应适当水解温度 温度加速水解 2 葡萄糖的复合反应及其影响因素复合反应 葡萄糖分子间经1 6糖苷键结合成龙胆二糖 有苦味 异麦芽糖和其他低聚糖 合称复合低聚糖 在淀粉的酸水解过程中 水解生成的葡萄糖受酸和热的影响 葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合 生成二糖 三糖及其他低聚糖 影响复合反应的因素 1 淀粉浓度的影响 淀粉乳浓度高 水解所得葡萄糖浓度也高 复合反应也强 2 酸的影响 酸浓度高 复合反应强 盐酸 硫酸 草酸 3 葡萄糖的分解反应及其影响因素分解反应 葡萄糖 5 羟甲基糠醛 有机酸 乙酰丙酸 蚁酸 色素等 影响因素 1 浓度 表2 9 葡萄糖浓度高 5 羟甲基糠醛生成量大 2 pH值 表2 11 pH为3时5 羟甲基糠醛生成量最小 3 反应时间 表2 10 时间延长 5 羟甲基糠醛生成量增大 第三节糖蜜前处理 一 糖蜜的来源与特点甘蔗厂 甜菜厂的副产物 非结晶糖 可发酵 无需糖化 甘蔗糖蜜 甜菜糖蜜的成分 表2 12总糖含量50 左右胶体物质约10 灰分约10 Bx 玻利克斯 锤度 表示溶液的比重的方法定义 某一溶液的Bx 表示该溶液的比重和相同浓度 为Bx 的蔗糖溶液的比重相等 二 糖蜜前处理的方法处理目的 a 除去胶体性物质 降低糖蜜的粘度 提高发酵液的流动性 有利于改善发酵过程中氧的传递 b 脱色 除去有色物质 色素对产品的质量有影响 对微生物的生长和代谢有影响 c 中和过量的酸碱性物质 除去部分对pH值有影响的缓冲性物质 处理方法 1 加酸通风沉淀法 冷酸通风处理法 程序 稀释 加酸 通气 静置 取上清制备糖液2 加热加酸沉淀法 热酸通风沉淀法 程序 稀释 加酸 加热 通气 静置 取上清制备糖液糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质 通风的目的是除去一些挥发性物质 3 添加絮凝剂澄清处理法 聚丙烯酰胺 程序 稀释 加酸 加热 加絮凝剂 静置 取上清制备糖液聚丙烯酰胺 PAM 作为絮凝剂 可以促进大分子物质的沉降 有利于糖蜜的澄清 工艺过程 原溶液 稀释 40Bx 调pH值 3 3 8 絮凝 加热到90 静置絮凝剂的用量 8mg L 静置时间 1小时 三 谷氨酸发酵糖蜜前处理糖蜜中生物素含量高 不适合谷氨酸发酵1 糖蜜预处理法 活性炭处理法 树脂处理法 亚硝酸处理法2 添加化学药剂处理法 添加青霉素法 破坏细胞壁结构 添加表面活性剂 改变细胞膜的通透性 添加抗氧剂法 3 追加糖蜜法生物素只对谷氨酸产生菌初期有作用 待菌酶系生长完全后 生物素无作用 因此 可先用无生物素的糖蜜发酵 在用不经处理的糖蜜 4 营养缺陷型突变株法 将生物素缺陷型转变为其他类型的缺陷型 如油酸缺陷型 组氨酸缺陷型等 生物素对它没影响 第四节纤维素代粮发酵 一 石油代粮发酵20世纪中期研究较热石油消耗加速 价格上升微生物可利用石油的各种馏分二 纤维素代粮发酵1 纤维素的结构D 吡喃葡萄糖环 1 4糖苷键 直链多糖两相共存学说 结晶区 分子链有序 紧密 无定形区 分子链疏松 酶催化降解 成本高 但发展前景好 第五节前体物质 促进剂一 生物合成的前体物质前体指某些化合物加入到发酵培养基中 能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去 而其自身的结构并没有多大变化 但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高 特别是对于某些氨基酸 核苷酸和抗生素的发酵生产 添加一定量的前驱物质 前体 其作用是非常明显的 前体物质还可避免氨基酸合成途径中的反馈抑制 青霉素 分子量356苯乙酸 分子量136 作用 前体有助于提高产量用量 前体的用量可以按分子量衡算 具体使用有个转化率的问题 例 发酵生产6000单位 ml的青霉素G 需要添加多少苯乙酸 青霉素 6000 0 6 微克 36mg ml苯乙酸 36 136 356 13 8mg ml 1 38 实际使用时的转化率在46 90 之间用法 1 前体使用时普遍采用流加的方法2 前体一般都有毒性 浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸 一般基础料中仅仅添加0 07 3 前体相对价格较高 添加过多 容易引起挥发和氧化 流加也有利于提高前提的转化率 氨基酸发酵的前体物质 二 发酵过程的促进剂和抑制剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物 又非前体 但加入后却能提高产量的添加剂 所谓抑制剂是指那些非细胞生长所必须的营养物 又非前体 但加入后却能抑制某种抗生素的合成 促进剂提高产量的机制还不完全清楚 其原因是多方面的 1 有些促进剂本身是酶的诱导物 2 有些促进剂是表面活性剂 可改善细胞的透性 改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用 3 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子 抗生素的抑制剂 第六节培养基灭菌 重点 消毒与灭菌的区别 灭菌方法 加热灭菌的原理 影响培养基灭菌的其他因素 培养基灭菌时间计算 分批灭菌和连续灭菌比较 难点 培养基灭菌时间计算 一 消毒与灭菌的区别 所谓灭菌就是杀死一切微生物 包括微生物的营养体和芽孢 消毒是指消灭一切致病微生物 病原体 二 消毒与灭菌在发酵工业中的应用牛奶巴氏消毒法 80 95 10min发酵培养基的灭菌 121 20min 三 灭菌方法 1 干热灭菌 灼烧灭菌 加热方式有电热 红外线加热等 相对与湿热灭菌 干热要求时间长 温度高 一般160 2hr 1 火焰焚烧法 接种环 试管口等2 干烤法 利用热空气灭菌用法 160 2小时特点 由于空气传热穿透力差 菌体在脱水状态下不易杀死 所以温度高 时间长 2 湿热灭菌 蒸气释放热量 使微生物蛋白质变性 特点 温度低 时间短 灭菌效果好原因 1 菌体内含水量越高 则凝固温度越低 2 蒸汽冷凝会放出潜热 3 饱和水蒸汽穿透力强 4 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定性 主要破坏氢键结构 湿热灭菌优点 1 蒸气来源易 低价无毒 2 蒸气穿透力强灭菌彻底 3 蒸气冷凝释放热量 4 蒸气易输送 易调节 易管理 湿热灭菌缺点 1 设备费用高 2 不能用于怕受潮的物料 3 射线灭菌法 1 电离辐射 射线 原理 引起水和其他物质的电离 产生游离基 破坏DNA 从而造成细胞损伤 特点 穿透力强 无专一性 对所有生物均有杀伤作用 适用 菌种诱变 2 非电离辐射 紫外线 方法 在波长265 266nm处 杀菌力最强 原理 1 作用于DNA 使同链DNA相邻嘧啶间形成嘧啶二聚体 引起DNA结构变形 阻碍正常的碱基配对 从而造成菌的变异或死亡 光复活酶可修复 2 有氧时产生过氧化氢 强氧化杀菌 适用 空气 水的消毒杀菌 紫外灯 特点 穿透力差 4 化学药品灭菌 方法 浸泡 熏蒸 喷洒 擦拭等 常用化学药品 1 表面消毒剂 1 酚类 石炭酸 苯酚 0 1 抑菌 1 杀菌甲酚皂 甲酚 肥皂 3 5 皮肤消毒机理 作为表面活性剂 使膜损伤 蛋白质变性P C 石炭酸系数 为消毒剂杀菌效率的标准 是在一定时间内 10min 被测试的药剂能杀死全部供试微生物的最高稀释度与达到同样效果的酚最高稀释度的比值 2 醇类 乙醇 70 75 杀菌效率最高机理 具脱水作用 能穿透菌体进入蛋白质分子肽链间隙 使蛋白质变性或脱水沉淀 造成微生物死亡 无水乙醇 表面蛋白凝固 保护膜 杀菌力差甲醇可使眼睛失明 故不宜做消毒剂 其他醇因不溶于水 一般不用 3 醛类 甲醛 机理 蛋白质烷化剂 应用 福尔马林 40 10 的甲醛熏蒸 用于空气灭菌 4 表面活性剂 可降低表面张力效应的物质 机理 使菌体细胞膜破损 使菌体蛋白质变性 种类 洗必泰 新洁尔灭等特点 快速 彻底 效率高 5 氧化剂类 机理 破坏蛋白质的巯基 强氧化剂可破坏蛋白质的氨基与酚羟基碘酒7gI 5gKI 溶于100ml95 乙醇 1 碘酒10min可杀死芽孢杆菌和部分真菌 并使流感病毒灭活 漂白粉 氯化钙与次氯酸钙的混合物 6 重金属及其化合物 所有重金属盐Cu As Ag Hg等对微生物均有毒性 机理 1 可与酶蛋白的 SH基结合 使酶失活 2 易与带阴电荷的菌体蛋白吸附 使之变性沉淀 应用 波尔多液 红汞 硝酸银等 特点 简便 但使用应谨慎 防止在体内积累 7 pH的杀菌作用酸 蛋白质变性无机酸 杀菌力与H 浓度成正比 有机酸 与不电离的部分成正比 故有时有机酸的灭菌效果 无机酸 分子杀菌力大于离子 碱 强碱造成蛋白质 核酸大分子变性 水解 使菌死亡 2 抗代谢药物 机理 与正常代谢产物同时存在 并产生竞争性拮抗作用 与相应酶竞争性结合 只有当正常代谢产物的量少或不存在时 抗代谢物才有用 种类 磺胺 抑制叶酸合成6 巯基嘌呤 抑制嘌呤合成5 甲基色氨酸 抑制氨基酸合成机理 磺胺 对氨基苯甲酸的类似物 竞争性地与二氢叶酸合成酶结合 抑制叶酸合成 3 抗生素 1 抗生素 生物产生的一种次生代谢产物或其衍生物 在低浓度下抑制或影响其他生物的生命活动 2 抗菌谱 抗生素的作用对象有一定范围 将这一范围称该抗生素的抗菌谱 广谱 对多种微生物有作用 四环素G G 窄谱 仅对某一类微生物有作用 青霉素G 3 效价 抑菌圈大小 生物活性单位 标准曲线 抗生素作用机理 1 对细胞壁形成有抑制作用 如 青霉素 2 影响细胞膜功能 如 多粘菌素 3 抑制蛋白质合成 如 绿霉素 链霉素 4 干扰核酸代谢 如 利福霉素 灰黄霉素 抗药性 变异 适应 进化原因 药物无效 药物被修饰 R质粒 药物抗性基因 四 加热灭菌的原理 1 微生物的热阻 微生物对热的抵抗力 定义 微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力 其对热的抵抗能力越大 可以理解为热阻越大 衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小 可以使用相对热阻的概念 相对热阻 两种微生物的热阻之比 例如 芽孢 大肠杆菌 3000000 1 病毒 大肠杆菌 1 5 1致死温度 杀死微生物的极限温度 致死时间 在致死温度下 杀死全部微生物的时间 温度越高 致死时间越短 2 微生物的热致死动力学 对数残留方程 菌体是一个复杂的高分子体系 其受热被杀死 主要的原因是高温能使蛋白质变性 这种反应属于单分子反应 一级反应 因此 杂菌在一定温度下受热死亡的过程可用单分子反应历程加以描述 dN dt k N式中dN dt 表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率N 表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数K 表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数 上式的积分形式为 t 2 303 k lnN0 Nt式中 N0 Nt 分别表示灭菌前 灭菌后培养基中菌体的浓度 个 ml 灭菌时间t取决于污染程度N0 灭菌程度Nt与灭菌速度常数K灭菌程度 对于Nt 如果取Nt 0 那么 t 这显然是与现实情况不符 对于如何Nt取值 通常取Nt 10 3 即灭菌1000次 有一次是失败的 残留了一个活菌体 这个数值的取值的大小 也间接反应了该生产过程中的技术管理水平 3 热致死反应的速度常数KK是表达微生物耐热性的特征常数 K除了决定于菌体的种类及存在形式外 还是温度的函数 与普通化学反应一样 因此灭菌温度的选择是灭菌操作的核心 K越小 该微生物越耐热 121 细菌芽孢K为1min 1 而营养细胞为10 1010min 14 杀灭芽孢的温度和时间见表4 24 42页 不同芽孢耐热性不同 培养条件不同 耐热性也不同 5 灭菌温度的选择温度对化学反应的影响特别显著 主要是影响速度常数 灭菌温度的选择应考虑的因素主要有 1 微生物的热致死温度 应高于该温度 通常以芽孢为准 2 高温对营养成分的破坏 灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程 因此 灭菌温度的选择 应是在保证灭菌效果的前提下 尽可能减少培养基中营养成分的破坏 速度常数与温度之间的关系 阿累尼乌斯公式 K A e E RT 式中 K 速度常数 1 SE 活化能 J mol R 气体常数 1 987 4 18J mol kT 反应的绝对温度 k上式也可表示为 lgK E 2 303RT lgA对于某