水稻的蛋白质、核酸提取分析综合大实验.doc

水稻的蛋白质、核酸提取分析 前言：水稻是全世界最重要的粮食作物之一，其栽培面积和总产量仅次于小麦。我国是稻谷生产的大国。近年来水稻播种面积为世界第二，产量稳居第一。由于亚洲30多亿人口中4/5及非洲和拉丁美洲近30亿人口中1/3均以稻米为主要食物来源，所以水稻生产对发展中国家的重要性尤为突出。我国目前还是一个农业大国，搞好水稻的种植和研究对于国计民生具有重大意义。 一、实验目的：1、掌握水稻的催芽技术；2、掌握水稻的蛋白质、核酸提取分析技术；3、加深对生物大分子提取分离技术、分光光度技术、凝胶电泳技术、高速离心分离技术的理解和运用。4、掌握PCR、蛋白质印迹、SDS-PAGE等分子生物实验技术。二、实验材料：水稻三、综合大实验模块及流程图：1. 水稻材料准备2.1 水稻过氧化物同工酶的电泳分析3. 结果分析、讨论，书写实习报告2.3水稻DNA提取分析及聚合酶链式反应扩增水稻PsbA-trnH片段2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析水稻种子蛋白质四、实验时间安排计划：（一）第一周 周一：查阅资料，药品准备、水稻的选种、浸种； 周二：查阅资料，药品准备、稻种消毒；稻种破胸、培养；记录； 周三: 实验讲解、药品准备，水稻过氧化物同工酶的电泳 周四: 水稻过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析; 周五: 水稻种子蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（二）第二周 周一：水稻DNA提取及聚合酶链式反应扩增PsbA-trnH片段； 周二：Western-blot 检测人类TES蛋白在大肠杆菌中的诱导表达； 周三：数据整理、结果分析、讨论，书写实习报告。1. 水稻的催芽培养 一、 实验目的：掌握水稻种子的浸种、消毒和催芽技术，以及实验室条件下水稻幼苗的培养方法。二、 实验原理： 水稻种子萌发需要的基本条件是种子活力、水分、温度和空气，对于处在非休眠期的种子来说，满足以上条件，就可以萌发生长。水稻种子常带有稻粒黑粉病、恶苗病、胡麻斑病、绵腐病和稻瘟病等病菌。因此，进行稻种消毒处理，是防止病菌侵入，减轻水稻病害发生的重要措施。三氯异氰尿酸是一种高效、广谱、低毒、安全的消毒剂。为白色结晶性粉末，含有效氯8085%，具有氯臭味，在水中分解成异氰尿酸和次氯酸，次氯酸扩散到细菌表面，并穿透细胞膜直接氧化菌体蛋白，从而消灭病原微生物，是一种极强的氧化剂，对细菌、病毒、真菌、芽孢有较强的杀灭作用。三、器材与试剂：1、器材：恒温水箱、培养皿、恒温光照培养箱、500ml烧杯、玻棒、消毒脱脂棉2、试剂：85强氯精（三氯异氰尿酸）300500倍液四、 实验材料：水稻种子五、 实验步骤（一）种子的浸种消毒：1强氯精浸种：稻种先用清水浮选、预浸（早稻常规24小时，杂交稻12小时）吸水，再用85强氯精300500倍液浸24小时，浸后清水35次洗净再催芽。2多菌灵浸种：50超微多菌灵可湿性粉剂500倍液浸种（即100克多菌灵兑水50公斤，可浸种子3540公斤）48小时，浸后洗净再催芽。3. 使百克浸种：用25使百克乳油25003000倍液浸48小时，浸后可直接进行催芽播种。（二）种子的破胸催芽：将消毒清洗后的稻种沥去明水，在40的干净热水中加热1530分钟，也可用烧杯装种子和清水的混合物（1：1）进行水浴，期间搅拌数次，促进水稻种皮的发胀破裂。在培养皿内铺1厘米厚的消毒棉花，将加热后的稻种捞出，均匀摊在棉花表面，加入与棉花等高的清水，放入温度28、湿度80%的培养箱里光照培养。每天观察一次，并及时浇水。六、注意事项1.清水浮选和消毒时要剔除秕谷和病谷，以免以后长菌；2.培养时浇水要适量，过多易导致根部发霉。2. 1 植物组织中过氧化物酶同工酶的电泳分析聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳一目的要求 同工酶是一组催化相同化学反应，而结构、理化性质及在组织中的分布均不同的酶。由于同工酶广泛分布于各种生物体内，并且在表达上具有组织特异性、器官特异性和生长发育时期的特异性，所以，通过分析同工酶，可以从分子水平研究植物的生长发育规律和遗传变异规律。本实验要求掌握过氧化物酶同工酶的电泳分析原理及柱状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺（简称TEMED）的催化下，聚合而成的具有三维网状结构的凝胶。通过改变凝胶的浓度和交联度，来控制凝胶孔径的大小；通过改变催化剂的用量，控制凝胶聚合的速度。本实验采用不连续的电泳体系，使样品在不连续的两相之间积聚浓缩成很薄的起始区带（约102cm），然后再根据电荷效应和分子筛效应进行分离。电泳区带用特异性染色法显示出过氧化物酶同工酶的酶谱。三实验材料、仪器及试剂仪器：CR21G高速冷冻智能离心机 日本日立公司24DN制胶玻璃板 北京六一仪器厂DYCP3313型电泳槽 北京六一仪器厂微量注射器 上海安亭微量进样厂烧杯 研钵 培养皿 电冰箱 滴管试剂： 1N HCl 48mlA： Tris 36.6克 用蒸馏水定容至 100ml，pH8.9 四甲基乙二胺（TEMED） 0.24毫升 Acr 28克C： 蒸馏水定容至100ml Bis 0.74克G： 过硫酸铵 0.56克，用蒸馏水定容至100ml，现用现配。 1N HCl 48mlB： Tris 5.98克 蒸馏水定容至 100ml，pH6.7 四甲基乙二胺（TEMED） 0.46毫升 Acr 10克D： 蒸馏水定容至100ml Bis 2.5克F： 蔗糖40g加水溶解定容至100ml。E：电极缓冲液 Tris 6克 蒸馏水定容至 1000ml，pH8.3， 甘氨酸 28.8克 临用时稀释10倍H：显色溶液（1）称取0.25克联苯胺溶解在18ml冰醋酸中，用水定容至100ml；（2）3HO 临用时取（1）10ml，取（2）5ml，加水稀释至50ml。I：固定液 ： 7的醋酸溶液J：前沿指示剂： 0.1溴酚兰溶液实验材料： 萌发45天的水稻幼苗四实验步骤及方法 凝胶柱制备：（） 将洗净烘干的凝胶电泳玻璃管一端插在疫苗瓶的橡皮帽中，或用其 它材料将玻璃管一端封闭。将封闭的一端朝下垂直插入制胶板上。（） 下层胶的制备：将试剂A、C、G、水以1：2：1：4的比例混合配制于小烧杯中（用量根据玻璃管大小而定），用皮头吸管吸取胶液灌入玻璃管内约6.5cm高（可预先做记号）。然后立即顺管壁（不要滴加）加入35mm高的水层，以隔离空气加速凝胶的过程，加水时一定要防止搅动胶面。约30min后凝聚成胶，此时胶与水之间形成一条明显的界限。倒出胶面上的水，并用滤纸条吸干。（） 上层胶的制备：将试剂B、D、G、F以1：2：1：4的比例混匀。先用部分胶液冲洗分离胶面，倒出，再立即灌入余下的浓缩胶约1cm，然后按上述方法小心地加一层水。约30min聚合完全，吸去水层，用电极缓冲液洗涤胶面，再用滤纸吸干。将已加好样品的胶管，轻轻除去下端的皮塞或封闭物，将管插入圆盘电泳槽孔中，记录各管所在编号位置。管要插得垂直，插好后，加电极缓冲液，至少盖过管顶，检查是否漏水，若不漏水，即可在上下电泳槽中加满电极缓冲液，然后点样电泳。样品的制备及点样：取2 g萌发45天的水稻幼苗，剪碎后，放在研钵中，加入适量（10ml）的电极缓冲液，研成匀浆。在10000g离心5分钟，取上清液2ml，加入等体积40蔗糖和1ml 0.1溴酚兰混匀。用微量进样器吸取100l样品液，让针头穿过胶面上的缓冲液，慢慢推动进样器，使样品落在胶面上。推动时不宜过猛，以免样品与缓冲液混合。电泳： 接通电源，负极在上，正极在下。电泳初始期电压控制在7080V，待样品进入分离胶后，加大电压到100120V，继续电泳。当溴酚兰指示剂移至距胶管底部1cm处时停止电泳，关闭电源。倒出电泳槽中的电极缓冲液，取出凝胶玻璃管。用带长注射针头（10cm）的注射器吸满蒸馏水。针头插入玻璃管壁与凝胶之间，边插入边注水，并使针头沿管壁转动，直到胶条脱离玻璃管滑出。若仍不自动滑出，可用洗耳球轻轻把凝胶柱吹出。但不能用力过大，以免凝胶滑出过猛而断裂。整个过程要求动作慢，细心，以保证获得好的实验结果。染色： 将取出的凝胶放入培养皿中，加入染色液，染色至可见清晰的过氧化物酶同工酶棕色谱带，弃去显色剂。用蒸馏水清洗凝胶柱，然后将凝胶柱放入7的醋酸溶液中保存。过氧化物酶同工酶显色后，天内可保持清楚。结果观察和记录：观察过氧化物酶同工酶的酶谱，并绘出模式图。五实验数据（照片）六 实验结果经过氧化物同工酶显色后观察到，进样量为时，实验材料共产生了同工酶色谱带；进样量为时，实验材料共产生了同工酶色谱带；进样量为时，实验材料共产生了同工酶色谱带；七. 实验分析2. 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定水稻种子蛋白质的分子量一、目的要求（1）学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法。（2）掌握板状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。二、实验原理天然蛋白质在电场中泳动的迁移率主要取决于其所带电荷的多少、分子量大小及分子的形状等因素。在有阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）存在时，蛋白质的迁移率则主要取决于它的分子量大小，而与其所带电荷的多少及形状无关，并且蛋白质的电泳迁移率与其分子量的对数呈直线关系。欲测定某蛋白质的分子量时，只要将该蛋白质与几种已知分子量的标准蛋白质置于相同的条件下进行电泳，根据测得的迁移率即可通过标准曲线求得其分子量。实验证明，分子量在12000 200000道尔顿之间的蛋白质，用此法测分子量与用其他测定方法相比，误差一般在10%以内。此方法具有重复性高，样品用量少，设备简单，操作方便等优点，现已成为测定蛋白质分子量的常用方法。本实验选用分子量在10000 70000道尔顿范围的标准蛋白质制作标准曲线，使用10% 的聚丙烯酰胺凝胶并制成板状，以不连续电泳系统进行电泳来测定蛋白质的分子量。三、实验材料、仪器和试剂1.试剂（1）低分子量标准蛋白质的组成（纯品）：蛋 白 质 名 称分 子 量（道尔顿）兔磷酸化酶B97,400牛血清白蛋白66,200兔肌动蛋白43,000牛碳酸酐酶31,000胰蛋白酶抑制剂20,100鸡蛋清溶菌酶14,400 使用方法：开封后溶于200微升重蒸水中，分装于20个小管内，每小管10微升，再于每小管内加入等体积2样品缓冲液（10微升），置20保存。使用前置室温融化后，沸水浴中加热3 5分钟后上样。 2样品缓冲液： 0.5 M Tris HCl ，pH6.8 2.0毫升 甘油（丙三醇） 2.0毫升 20%（W/ V）SDS 2.0毫升 0.1%（W/ V）溴酚兰 0.5毫升 2-巯基乙醇 1.0 毫升 重蒸水 2.5毫升（2）凝胶试剂a 30%丙烯酰胺（W/ V）： 30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100mL蒸馏水中，过滤。于4暗处贮存，一月内可使用。b 1mol/L，pH8.8TrisHCl缓冲液： Tris121g溶于蒸馏水，用6N HCl调至pH8.8，用蒸馏水定容至1000mL。c 1mol/L，pH6.8TrisHCl缓冲液： Tris121g溶于蒸馏水，用6N HCl调制pH6.8，用蒸馏水定容至1000mL。d 10%（W / V）SDS（十二烷基硫酸钠）e 10%（W / V）过硫酸铵（临用前配制）f TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺）（3）样品稀释液： SDS 500mg，巯基乙醇1mL，甘油 3mL，溴酚蓝4mg，1mol/L，pH6.8TrisHCl缓冲液2mL，加蒸馏水溶解并定容至10mL。此溶液可用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品，样品若为固体，应稀释1倍使用；样品若为液体，则加入与样品等体积的原液混合即可。（4）电极缓冲液（pH8.3）： Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS10g，溶于蒸馏水并定容至1000mL。使用时稀释10倍。（5）染色液：1g考马斯亮蓝R-250，加入450mL甲醇和100mL冰醋酸，加450mL蒸馏水溶解后过滤使用。（6）脱色液：70mL冰醋酸，730mL蒸馏水与200mL甲醇混合。（7）凡士林油膏或马铃薯淀粉 器材：DYY-27B型电泳槽 北京六一仪器厂DYY-5型稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂烧杯 注射器 3.实验材料： 稻米粉四、实验步骤及方法1垂直板状制胶模具及电泳槽： 一般的制胶模具由两块长短不等的玻璃板组成，其中一块的一端带有12cm高的凹槽。将两块玻璃板洗净干燥后，在带凹槽玻璃板的两侧及底部放置用特殊塑料制成的“间隙条”，条的厚度根据需要选定。然后放上另一块玻璃板，将板的两侧及底部用凡士林油膏或马铃薯淀粉糊封闭，以防胶液漏出，并用夹子将两块玻璃板固定。这样两块玻璃板之间就形成了一定的间隙，可以灌注胶液。2制备分离胶：从冰箱中取出制胶试剂，平衡至室温。按下表配制所需浓度的分离胶，本实验中分离胶的浓度为10%，凝胶液总用量根据玻璃板的间隙体积而定。凝 胶 浓 度5%7.5%10%12.5%15%30% 丙 烯 酰 胺 （ml）5.07.51012.5151mol/Ltris-HCl，pH8.8 （ml）11.211.211.211.211.2蒸 馏 水 （ml）13.711.28.76.23.7抽 气10% SDS （ml）0.30.30.30.30.310% 过硫酸铵 （ml）0.20.20.20.20.2TEMED （ml）0.010.010.010.010.01将上述胶液配好，混匀后，迅速注入两块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽3.5cm左右。然后在胶面上轻轻铺1cm高的水，加水时应顺玻璃板慢慢加入，勿扰乱胶面。垂直放置胶板于室温约2030分钟左右使之凝聚。待凝胶和水之间可以看到很清晰的一条界面时，吸去胶面上层的水。3制备浓缩胶：无论使用何种浓度的分离胶，都使用同一种浓缩胶，其用量根据实际情况而定，制备方法按下表：30% 丙烯酰胺 （ml）1mol/L Tris-HCl，pH6.8（ml）蒸馏水 （ml）10% SDS （ml）10% 过硫酸铵 （ml）TEMED （ml）1.671.257.030.10.20.01 混合上述溶液，用少量灌入玻璃板间隙中，冲洗分离胶胶面，而后倒出。把余下的胶液注入玻璃板间隙，使胶液面与玻璃板凹槽处平齐，然后插入“梳子”，在室温放置2030分钟，浓缩胶即可凝聚。凝聚后，慢慢取出“梳子”，应避免把胶孔弄破。在形成的胶孔中加入蒸馏水，冲洗未凝聚的丙烯酰胺，倒出孔中的蒸馏水后，再加入电极缓冲液。将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴在一起，形成一个贮液槽，向其中加入电极缓冲液，使其与胶孔中的缓冲液相接触。在电泳槽下端的贮液槽中也加入电极缓冲液。4水稻蛋白样品的制备及点样：取2 g稻米粉，放在研钵中，加入适量（10ml）的电极缓冲液，研成匀浆。在10000g离心5分钟，取上清液2ml，加入等体积的样品稀释液。5加样： 样品的点样体积根据样品溶液的浓度及凝胶点样孔的大小确定，一般在10100l之间。加样量过少不易检测出来，样品中至少应含有0.25g的蛋白质，染色后才能检测出来。如蛋白质含量达到1g，测显色十分明显。6电泳：将电泳槽与电泳仪相连接，上槽接负极，下槽接正极。打开电源开关，将电流调至5080mA（可根据凝胶板的横截面积适当增减）。保持电流强度不变，进行电泳，直至样品中溴酚蓝染料迁移至离下端1cm时，停止电泳。将上下电泳槽中的电极缓冲液倒出，取下玻璃板，小心地将凝胶片从玻璃板中取出，并滑入一白磁盘或大培养皿内。用直尺测量分离胶的长度及分离胶上沿至溴酚蓝带中心的距离，或在溴酚蓝带的中心插入一段细铜丝，以标出染料的位置。7染色和脱色： 将分离胶在染色液中浸泡2030分钟左右，倒去染色液，用蒸馏水漂洗凝胶一次，然后加入脱色液，室温浸泡凝胶或37加热使其脱色，更换几次脱色液，直至蛋白质区带清晰为止。将胶片小心放在一块玻璃板上，用直尺测量脱色后分离胶的长度及各蛋白质区带的迁移距离（即分离胶上沿至各蛋白质区带中心的距离），或者测量由胶上沿至铜丝的距离和至各蛋白质区带的距离。8.蛋白质分子量的计算：蛋白质样品区带的相对迁移率按下列公式计算： 蛋白质迁移距离 染色前胶长相对迁移率 = 脱色后胶长 染料移动距离 插铜丝方法的相对迁移率按下列公式计算： 样品蛋白质迁移距离相对迁移率 = 染料迁移距离 以各标准蛋白质样品的迁移率为横坐标，蛋白质分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，即可得一条标准曲线。也可以取蛋白质分子量的对数值为纵坐标，用一般坐标纸作图。根据待测样品蛋白质的迁移率，从标准曲线上查出其分子量。五实验原始数据（照片）本实验称取的稻米粉为g，根据实验室实际温度以及具体实验预作操作步骤，制备浓缩胶及分离胶分别采用的TEMED的含量分别为和，经脱色后，用直尺量得分离胶的长度为各蛋白质区带的迁移距离为。六. 实验结果由实验数据可知，用直尺量得于脱色后分离胶的长度为，蛋白质区带的迁移距离为。因此， 蛋白质迁移距离 染色前胶长相对迁移率 = 脱色后胶长 染料移动距离 =七. 实验分析1本实验中，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时需使用SDS，是因为SDS能打开蛋白质分子的氢键和疏水键，使蛋白质变性呈松散线状。同时，大多数蛋白质都能与SDS按1：1.4的比例结合，形成易溶解的蛋白质-SDS复合物。其结果： 使蛋白质分子都带上了大量相同密度的负电荷，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别； 改变了蛋白质的原有构象，使所有蛋白质的形状都近似长椭圆柱形，这样SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响，而只取决于椭圆柱的长度，也即蛋白质分子量的大小。2. 准确测定蛋白质分子量需注意以下问题：（1）要使SDS与蛋白质充分按比例结合，必须将蛋白质的二硫键完全打开。因此，在用SDS处理蛋白质样品时，必须同时用还原剂巯基乙醇处理，使二硫键还原打开。当有多余的巯基乙醇存在时，巯基将不会再氧化为二硫键。此外，要保证蛋白质与SDS按比例结合，溶液中的SDS总量至少要比蛋白质的量高约310倍以上。（2）实验中应该选择使用那些分子量大小与待测蛋白质样品相近的标准蛋白质作标准曲线，并使待测蛋白质样品的分子量恰好在标准蛋白质的范围内，而且标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2 0.8之间均匀分布。由于凝胶电泳中影响迁移率的因素较多，很难每次都将各项条件控制的完全一致，因此，每次测定样品必须同时作标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。（3）不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶适用于不同范围的蛋白质分子量测定。如15%的凝胶适用于分子量在10000 50000道尔顿范围的蛋白质，使用时应根据待测蛋白质样品的分子量范围，选择合适的凝胶浓度，以求获得好的结果。（4）此法虽然适用于大多数蛋白质分子量的测定，但对于一些带有较大辅基的蛋白（如某些糖蛋白）和结构蛋白（如胶原蛋白）等，因其电荷异常或构象异常，不能定量地与SDS相结合或正常比例的SDS不能完全掩盖其原有电荷的影响，造成测定结果偏差较大。此外，由亚基（如血红蛋白）或由两条以上多肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的蛋白质，在SDS的作用下将解离成亚基或单条多肽链，其电泳后测得的只是这些蛋白质的亚基或单条多肽链的分子量，而不是整个蛋白质的分子量。所以，这些“特殊”蛋白质的分子量测定需用其他方法与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。2.3聚合酶链式反应扩增水稻PsbA-trnH片段一、实验目的 1. 理解聚合酶链式反应（PCR）原理2. 掌握PCR技术在基因扩增中的应用3. 熟悉PCR仪的使用二、实验原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性退火延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。三、仪器设备 PCR仪，电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像系统，高速冷冻离心机，恒温水箱，移液枪，液氮罐，陶瓷研钵，灭菌锅，EP管实验一 DNA模板的制作（CTAB法）一、实验材料、仪器及试剂 1.仪器 恒温水箱 研钵 灭菌离心管 离心机 移液枪（200、1000 uL） 一次性枪头2.试剂：（1）CATB抽提缓冲液（2）液态氮（3）氯仿-异戊醇（24：1）（4）异丙醇（5）75%乙醇（6）灭菌蒸馏水（7）DNA提取成套试剂盒3.材料：水稻叶片二、实验方法 先对枪头、EP管、研钵等包装灭菌。A. 试剂盒提取方法操作步骤：1. 全班集中取10g水稻新鲜叶片，加入液氮充分碾压。得到水稻粉末后再分装；2. 将碾压好的粉末迅速转移到预先装有700l 65预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。3. 加入700l氯仿，充分混匀，12000rpm（13400g）离心5分钟。4. 小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入l 缓冲液GP2，充分混匀。5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm（13400g）离心30秒弃掉废液，吸附柱容积为700l左右，可分次加入离心。6. 向吸附柱CB3中加入500l 缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（13400g）离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7. 向吸附柱CB3中加入700l 漂洗液PW（使用前请先检查是否加入无水乙醇），12000rpm（13400g）离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8. 向吸附柱CB3中加入500l漂洗液PW，12000rpm（13400g）离心30秒，倒掉废液。9. 将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（13400g）离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10. 将吸柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200l洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm（13400g）离心2分钟,将溶液收集到离心管中。11. DNA浓度及纯度检测。得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50g/ml双链DNA、40g/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。注意事项：1.若提取富含多酚或淀粉的植物组织，则在第3步前，用酚：氯仿（1:1）进行等体积抽提。2.第九步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。3. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。4. 若缓冲液GP1和GP2中有沉淀，可在56水浴中重新溶解，并摇匀合使用。5. 所有的离心步骤都为使用台式离心机，可在室温下进行。实验二 PCR扩增一、实验材料、仪器及试剂 1、仪器和材料： PCR仪 琼脂糖凝胶电泳系统 凝胶成像系统 经高压灭菌的Eppendorf离心管 移液枪（10、200、1000 uL） 一次性枪头 DNA模板 引物1（PsbAf：5-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C-3由生物公司合成） 引物2（trnHr：5-CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC-3由生物公司合成） 2、试剂：（1）10PCR缓冲液（可购买商用品）： 500mmol/L KCL 100mmol/L Tris-Cl (pH8.3，室温) 15 mmol/L MgCl2 0.1% 明胶 1% Triton X-100 用时要稀释10倍。（2）dNTPs：2mM each，底物混合液中的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mmol/L（3）Tap酶： 2 .5U/uL（4）DNA模板： 自制，1ng/uL（5）引物溶液： 10pmol/uL二、实验方法1、准备PCR反应溶液在无菌0.5ml的Eppendorf管内加入以下反应物，配制成25uL反应体系： 反应物 体积（uL） 终浓度 （1）ddH2O 9（2）10PCR缓冲液 2.5 1缓冲液（3）dNTPs 2.5 200u mol/L每种dNTP（4）引物1：PsbAf：5-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C-3 2.5 25pmol/每个反应（5）引物2：trnHr：5-CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC-3 2.5 25pmol/每个反应（6）DNA模板 5 5ng/每个反应（7）Tap聚合酶 1 2.5U/每个反应加完后震荡，并离心15s混匀，并使液体沉至管底。2、扩增过程 （1）95预变性3min （2）94变形45s （3）63退火1min （4）72延伸1min （5）重复步骤（2）-(4) 38次 （6）72延伸20min。迅速冷却，并离心15s，上清液用于检测分析。产物置于4保存。3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果： （1）琼脂糖凝胶板的制备a将凹形有机玻璃内槽洗净、晾干。用胶布将内槽两端边缘封好，并放置于一水平位置，选择一适合的样品槽梳子插于内槽一端，注意梳齿底与凝胶之间应保持0.5-1.0mm的缝隙。b称取0.5克琼脂糖粉，置于锥形瓶中，加入50ml TBE稀释缓冲液。将瓶口盖一小烧杯，置沸水浴中加热，直至琼脂糖完全溶解。冷却至60左右，加入溴乙啶（或GV染料）水溶液10uL，混匀后倒入凹形内槽中。室温下放置30-45min，使凝胶完全凝固，取出梳子，去掉两端胶布，将凹形内槽放入电泳槽内。加入TBE稀释缓冲液，使之超过凝胶面约1mm。（2）加样 吸取需鉴定样品液10uL与10uL0.05%溴酚兰50%甘油溶液混合，也可使用商用6倍上样缓冲液，用移液枪吸取混合好的样品，然后穿过缓冲液缓慢加入凝胶样品孔中，使样品落入点样孔底，点样量为每孔5ug。注意每加完一个样品，要换一个枪头。如需测定样品DNA分子的大小，则在另一样品孔中加入1ug已知分子量的标准DNA与溴酚兰甘油液混合的样品。（3）电泳 样品加完后，应立即盖好电泳槽进行电泳。电泳时点样端接负极，打开电源，样品进入凝胶前，应使电流控制在10mA，样品进入凝胶后电流应保持在20mA左右。为了获得电泳分离DNA片段的最大分表率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚兰染料移动到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。一般10-15cm长度的胶板需电泳约2小时。（4）观察和鉴定 电泳结束后，取出凝胶板，利用凝胶成像系统，在波长为254nm的紫外灯下，观察电泳图谱。紫外光激发30秒钟左右，有DNA存在的地方会呈现出橙红色的荧光条带，如果使用GV则为绿色荧光。拍照记录电泳图谱，并根据标准DNA的电泳图谱，计算待测样品DNA的相对分子质量。注意事项：（1）枪头、Eppendorf管、研钵等要进行灭菌处理。（2）胶液温度不能太低以免倾倒时胶体快速凝固导致凝胶不均匀，电泳出来的条带歪斜。 三、有毒物质：（一）溴化乙锭：具有一定的致癌性，使用EB时需要带一次性塑料手套，防止污染设备，并及时处理污染区。实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。1、对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：（1）将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；（2）加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； （3）加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 2、EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： （1）按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时； （2）用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。3、废EB接触物，如一次性手套、抹布、枪头。 一般回收至黑色的玻璃瓶中，在生物危害柜定期进行焚烧处理。 电泳胶：胶里面痕量的EB没有问题，如果小于0.1可以直接扔掉。而如果发红，即大于等于0.1时应该放在生物危害柜中焚烧掉。 （二）新型核酸染料Goldview（GV）的危险性较小，但显色灵敏度和稳定性不及EB，使用方法为在60左右的100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%2%）加入5l GoldView。2.4几种水稻种子的蛋白质电泳谱带比较 一、实验目的 1、 应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对不同的品种稻米的蛋白质组成分析。 2、 得到不同大米之间的蛋白质电泳图谱上的特异条带 二、实验原理 天然蛋白质在电场中泳动的迁移率主要取决于其所带的电荷的多少，分子质量大小及分子的形状等因素。在有阴离子去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）存在时，SDS能打开蛋白质分子的氢键和疏水键，使蛋白质变性呈松散线状。蛋白质与SDS按1：1.4的比例结合，形成易溶解的蛋白质-SDS复合物。其可使蛋白质带上负电，掩蔽掉蛋白质的电荷，并可改变蛋白质的原有构想，使蛋白质的形状都近似长椭圆柱的形状，使所有的蛋白不再受原有电荷及形状的影响。使电泳只取决于椭圆柱的长度和蛋白质的分子量的大小。本实验用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法并使用沸水浴的染色和脱色方法，通过电泳、染色、脱色得到电泳条带图谱。通过成像系统分析不同对稻米蛋白质在图谱中的条带的不同，得到不同品种的电泳图谱的特异带，进而对不同的大米进行鉴别测定。三、实验材料、仪器和试剂1、材料：泰国香米（KDML 105）、银针香米（T优608）、珍珠米（垦稻10号）2、试剂：低分子量标准蛋白质 2样品缓冲液 30%丙烯酰胺（W/ V）1mol/L，pH8.8Tris-HCl缓冲液 1mol/L，pH6.8Tris-HCl缓冲液 10%（W / V）SDS（十二烷基硫酸钠） 10%（W / V）过硫酸铵（临用前配制） TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺） 样品稀释液 电极缓冲液（pH8.3） 染色液 脱色液 3器材： 稳压稳流电泳仪 DYY-5 北京六一仪器厂 板状电泳槽 DYY-27B 台式高速冷冻离心机 MIKRO 22R 分析天平 PL303 梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司 脱色摇床 TS-Y 电磁炉 恒温水箱 电吹风机 器皿：玻璃注射器3个，1500ul微量离心管16个，烧杯6个(50ml 2个，100ml 4个), 100ml容量瓶8个，药勺6个 ，10ml移液管8根，1ml移液管4根，5ml移液管4根，胶头滴管5个，移液枪4支（120 ul 1支、10ul100ul 1支、20ul200ul1支、100ul1000ul1支）,试管架2个,研钵3个,培养皿8个，100ml量筒2个，玻璃板6块，夹子15个，点样试管6个，剪刀1把，玻璃棒3根。四、实验步骤1垂直板状制胶模具制作1.1 选用两块长短不等的玻璃板，其中一块的一端带有12cm高的凹槽；1.2 将玻璃板洗净干燥后，在带凹槽玻璃板的两侧及底部放置用特殊塑料制成的“间隙条”，条的厚度根据需要选定；1.3 放上另外一块玻璃板，将板的两侧及底部用凡士林封闭，以防胶液漏出，并用夹子将两块玻璃板固定即可。2制备分离胶（下层胶）2.1 从冰箱中取出制胶试剂，平衡至室温。按下表配制分离胶：凝胶浓度12.6%30% 丙烯酰胺 （ml）6.251mol/L tris-HCL,pH8.8 (ml)5.6蒸馏水 （ml）3.110% SDS (ul)15010% 过硫酸铵 （ul）150TEMED (ul)102.2 上述胶液配制好，混匀后，迅速注入两块板的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽3.5cm左右；2.3 在胶面上轻轻铺1cm高的水，加水时应顺玻璃板慢慢加入，勿扰乱胶面；2.4 垂直放置胶板于5100C的凝胶时间是6090分钟,15200C的凝胶时间是4050分钟使之凝聚，30350C的凝胶时间是30分钟左右；2.5 待凝胶和水之间可以看到很清晰的一条界面时，吸去胶面上的水。3制备浓缩胶（上层胶）3.1 按下表配制浓缩胶：30% 丙烯酰胺 （ml）1.671mol/L tris-HCL,pH6.8 (ml)1.25蒸馏水 （ml）7.0310% SDS (ml)0.110% 过硫酸铵 （ul）100TEMED (ul)83.2 混合上述溶液，用少量灌入玻璃板间隙中，冲洗分离胶胶面，而后倒出；把余下的胶 液 注入玻璃板间隙，是胶液面于玻璃板凹槽处平齐，然后插入“梳子”， 垂直放置胶板于5100C的凝胶时间是6090分钟,15200C的凝胶时间是4050分钟使之凝聚，30350C的凝胶时间是30分钟左右 ；3.3 凝聚后，慢慢取出“梳子”，应避免把胶孔弄破；3.4 在形成的胶孔中加入蒸馏水，冲洗未凝聚的丙烯酰胺，倒出孔中的蒸馏水后，再加 入电极缓冲液；3.5 将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴在一起，形成一个贮液槽，向其中加入电极缓冲液，使其与胶孔中的缓冲液相接触，在电泳槽下端的贮液槽中也加入电极缓冲液。4样品准备4.1 称量预先用捣碎机磨碎的米样1g4.2 加2ml电极缓冲液和适量石英砂与研钵中进行研磨，研磨成浆即可；4.3 轻轻转移至离心管中，加3ml电极缓冲液冲洗研钵；4.4 放入高速离心机进行10000r/min离心10分钟；4.5 取上清液备用。4.6 取上清液和样品稀释液混合，其比例为1:1。4.7 沸水浴5分钟后冷却，等待加样。5.加样 样品的点样体积根据样品溶液的浓度及凝胶点样孔的大小确定，一般在10100ul之间。加样量过少不易检测出来，样品中至少应含有0.25ug的蛋白质，染色后才能检测出来。如蛋白质含量达到1ug时，测显色十分明显。5.1 用微量进样器吸去已处理好的蛋白质样品，将进样器针头穿过凝胶孔上的缓冲液，缓慢将样品加在凝胶表面，推时不宜用力过猛，以免样品扩散于缓冲液中。5.2 若使用一支微量进样器加样，则需要在加入第一个样品后，洗净微量进样器再吸去第二个样品，以免相互污染。6.电泳6.1 将电泳槽与电泳仪相连接，上槽接负极，下槽接正极；6.2 打开电源开关，将电流调至5080mA（可根据凝胶板的横截面积适当增减）；6.3 保持电流不变，进行电泳，直至样品中溴酚蓝染料迁移至离下端1cm时，停止电泳；6.4 将上下电泳槽中的电极缓冲液倒出