SDS—聚丙烯酰胺垂直平板电泳.ppt

SDS 聚丙烯酰胺垂直平板电泳 一实验原理 十二烷基硫酸钠 SDS 是一种阴离子去污剂 由于SDS分子本身带有负电荷 能够与蛋白质的疏水区相结合 使蛋白质伸展和解离 从而使蛋白质呈一致的强负电荷 当采用加SDS的聚丙烯酰胺进行电泳时 利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应 可以进行蛋白质分子量的测定 在用该方法进行分子量的测定中 是利用某些已知分子量的指示蛋白质与经SDS处理后解离成单链的蛋白质样品进行电泳比较 根据蛋白质的电泳迁移率 在一定的分子量范围内与分子量的对数所呈的线形关系 就可以测出单链样品蛋白质的分子量 用该方法测得的是蛋白质亚基的分子量 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以采用园盘电泳的形式 也可以采用垂直平板电泳的形式 其原理相同 操作步骤也大致相同 另外SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳亦分为不连续系统和连续系统 本实验采用垂直平板以不连续系统的SDS 聚丙烯酰胺凝胶方式进行电泳 垂直平板电泳的优点在于在一块凝胶平板上可以同时进行不同样品的电泳 因此条件一致 更加便于比较 二实验目的与要求 1 学习与了解SDS 聚丙烯酰胺垂直平板电泳的方法 2 通过对某一蛋白质样品的分子量测定 了解和掌握该方法的分子量测定技术 三实验仪器与器材 3 1 实验仪器 1 垂直平板电泳槽装置 套 2 电动磁力搅拌器 3 电动脱色仪 4 电泳仪 5 电炉 6 天平 7 混合器 3 2 主要实验器材 1 可调取液器 2 微量注射器 3 医用注射器 4 8 针头 5 烧杯 6 洗耳球 7 量筒 8 培养皿 9 吸水纸 10 记号笔 四实验试剂与配制 4 1 实验试剂 1 丙烯酰胺 Acr 2 甲叉双丙烯酰胺 Bis 3 过硫酸铵 AP 4 四甲基乙二胺 TEMED 5 三羟甲基氨基甲烷 Tris 6 考马斯亮兰G 25 7 十二烷基硫酸钠 SDS 8 2 巯基乙醇 EtSH 9 甘氨酸 gly 10 溴酚兰 11 甘油 12 盐酸 13 琼脂糖 14 甲醇 15 冰醋酸 16 牛血清白蛋白 BSA MW 66 200道尔顿 17 鸡蛋白蛋白 CEA MW 42 000道尔顿 18 低分子量标准指示蛋白 分子量范围10000 100 000 兔磷酸化酶 B RabbitPhosphorylaseb MW 97 400道尔顿牛血清白蛋白 BovineSerumAlbumin MW 66 200道尔顿兔肌动蛋白 RabbitActin MW 43 000道尔顿牛碳酸酐酶BovineCarbonicAnhydrase MW 31 000道尔顿胰蛋白酶抑制剂 TrypsinInhibitor MW 20 100道尔顿鸡蛋清溶菌酶 HenEggWhiteLysozymeMW 14 400道尔顿 4 2 试剂配制 1 电极缓冲液的配制 2 丙烯酰胺 Arc 和甲叉双丙烯酰胺 Bis 溶液的配制 3 10 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液的配制 4 10 过硫酸铵 AP 溶液的配制 5 pH8 8 1 5mol L三羟甲基氨基甲烷 HC1Buffer的配制 6 pH6 8 1 0mol LTris HC1Buffer的配制 7 四甲基乙二胺 TEMED 直接取原液 8 2 琼脂糖溶液的配制 用于封电泳槽渗漏 9 0 05 溴酚兰溶液的配制 10 样品溶液的配制 0 5mg 1 0ml 11 标准品溶液的配制 12 染色液的配制 13 样品溶解Buffer溶液的配制 1MTris HC1pH6 80 5ml甘油0 8ml10 SDS1 6ml2 巯基乙醇 EtSH 0 4ml0 05 溴酚兰0 2ml蒸馏水 DDW 4 5ml 8 0ml 需要同学自己配制的试剂溶液 14 脱色液的配制 400 500毫升 组冰醋酸 甲醇 水 7 5 5 0 87 5 V V 五方法与步骤 五方法与步骤 一 凝胶的聚合1 垂直平板电泳槽的装配2 分离胶及浓缩胶的配制3 分离胶的制备4 堆集胶的制备 二 加标准品和样品溶液1 加样量2 加样方法 三 电泳 四 处理凝胶区带1 染色2 脱色 五 鉴定 5 1 凝胶的聚合 5 1 1 垂直平板电泳槽的装配 1 在洁净的电泳槽和玻璃平板两边缘中间各添加一块小垫条 紧紧贴合四只夹子 一边二只 以致密封 2 用滴管吸取经沸水加热溶解的2 琼脂糖溶液 趁热灌注于玻璃平板的底槽 待琼脂糖凝固后 底层即封闭 需避免气泡 3 再在玻璃平板槽内用注射器 或滴管 加蒸馏水至满刻度 并观察是否有渗漏现象如有渗漏 则需要重新安装玻璃平板槽 应确保无渗漏 然后弃去槽内蒸馏水 并用吸水纸轻轻吸去槽内未弃尽的蒸馏水 5 1 2 分离胶及浓缩胶的配制 见下表 表1 分离胶及浓缩胶的配制 5 1 3 分离胶的制备 1 取一小烧杯 按表1比例配制分离胶 2 用带有长针头的注射器吸取分离胶混合贮液 慢慢注入垂直放好的平板槽内 直至胶液高度为7cm 取胶的注射器要及时用自来水冲洗干净 否则针头易堵塞 3 然后再在胶面仔细加注厚约0 5 1 0厘米的蒸馏水层 在室温下静置40分钟左右进行聚合 这时可根据界面现象进行辨别 当有明显的分层现象出现时 即表明凝胶已聚合完毕 4 聚合后将蒸馏水轻轻倒掉 并用吸水纸轻轻吸去垂直玻璃平板槽残留的蒸馏水 5 1 4 浓缩 堆集 胶的制备 1 取一小烧杯 按表1比例配制浓缩胶 2 将混合好的堆集胶贮液用带有长针头的注射器吸取加注到分离胶胶面上 直至高度约为2cm 3 再将梳板的梳齿插入到平板顶部的槽内 并保证梳齿的2 3部分浸没在堆集胶液内 如高度不够 可适量添加贮液 在室温下 静置40 60分钟 4 堆集胶聚合后 如果堆集胶面不用梳板 则可加水层以使界面平整 将梳板轻轻垂直地从顶槽内取出 这时即可出现一个个齿孔 凹槽 用小滤纸条吸去齿孔内残液 但不能触及和移动齿 5 2 加标准品和样品溶液 5 2 1 加样量 用微量注射器吸取 1 溴酚兰溶液10ul 0 05 溴酚兰 2 标准品溶液10ul 200ul 小小瓶 3 样品溶液5ul 0 5mg ml 5 2 2 加样方法 1 先加样 后加电极溶液 分别小心将样液加注到平板槽内的各自标记齿孔内 各孔内的样品不能相混 加样完毕后 将准备好的电极溶液分别轻轻倒入上 下电极槽内 特别是在加注上电极溶液时 一定要沿槽内壁轻轻加入 以防冲动各齿孔内的样品液所引起相互混合和扩散 2 先加电极溶液 后加样 也可先将上 下电极槽内加注电极溶液后 再在上槽各自标记齿孔内加样 这样可以完全避免在加电极液时所引起样品溶液相互混合和扩散 5 3 电泳 加完样品和电极液后 接上上 下电极的电源 电极一定要浸入电极溶液内 上电极接电泳仪负极 下电极接电泳仪正极 开启电泳仪 使稳压 120伏特 待溴酚兰指示前沿到达下端时 3少时左右 关闭电泳仪 停止电泳 5 4 处理凝胶区带 5 4 1 染色 将垂直平板电泳槽上的玻璃平板轻轻扳开 用不锈钢小铲刀 将凝胶板从电泳槽上面铲下来 放入一合适的干净培养皿内 然后加入适量染色液 于摇床上进行振摇固定染色30分钟 完毕 在培养皿中用清水洗2 3遍 5 4 2 脱色 在培养皿内加入适量脱色液于摇床上进行振摇 2小时 次 需3次 脱色多次直至色带完全清晰为止 5 5 鉴定 最后根据染色所出现的区带 测量和记录标准品和样品中各蛋白质的迁移率 绘制出类似凝胶板的图形 以标准品中的各自蛋白质的迁移距离 cm 为横坐标和相对应的对数分子量 LogMW 为纵坐标 绘制低分子量蛋白质标准曲