分子分离技术.doc

目录摘要1关键词11 前言12 传统分离方法23 现代分离方法33.1 色谱方法33.2 电泳技术及其它74 展望9参考文献10生物大分子分离技术的发展现状姓名：陈绍勇 学号：20124016016 专业：动物学摘要: 生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸( DNA 和RNA) 以及多糖等。生物大分子分离技术是生命科学研究中的关键技术之一。当前, 各学科之间的交叉渗透为生物大分子分离技术的发展提供了更多的契机。对以沉淀、透析、超滤和溶剂萃取为代表的传统分离技术, 以及色谱, 电泳等现代分离技术的发展概况、原理、特点及应用进行了综述。并结合生命科学的发展现状, 展望了生物大分子分离技术的发展前景。关键词: 生物大分子,传统分离方法,现代分离方法1 前言生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸( DNA和RNA) 以及多糖等。生命科学的发展给生物大分子分离技术提出了新的要求。各种生化、分子研究都要求得到纯的, 以及结构和活性完整的生物大分子样品, 这就使得其分离技术在各项研究中起着举足轻重的作用。对生物大分子分离技术的研究和开发也就应运而生。而且随着各学科之间的交叉渗透, 材料化学、自动化技术等学科的发展也为生物大分子分离技术的发展提供了更多的契机。生物大分子的制备具有如下主要特点: 生物材料的组成极其复杂; 许多生物大分子在生物材料中的含量极微, 分离纯化的步骤繁多, 流程长; 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境就极易失活( 因此分离过程中如何防止其失活, 就是生物大分子提取制备最困难之处) ; 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的, 温度、pH 值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响, 很难准确估计和判断1。这些都要求生物大分子的分离技术以此为依据, 突破这些难点, 优化分离程序, 以获得符合要求的生物大分子样品。2 传统分离方法常用的传统生物大分子分离方法有沉淀、透析、超滤和溶剂萃取等。它们都是一些较早就建立起来的分离方法, 至今仍然被广泛应用。如在蛋白质领域, 应用盐析法使蛋白质沉淀出来已有80 多年的历史。其突出的优点是成本低, 不需要特别昂贵的设备; 操作简单、安全; 对许多生物活性物质具有稳定作用2。该法虽然分辨能力不高,但在粗级分离中仍然被经常采用。有机溶剂沉淀法也是较早使用的沉淀方法之一。有机溶剂对于许多蛋白质、核酸、多糖和小分子生化物质都能产生沉淀作用。其引起沉淀的主要原因在于改变介质的介电常数, 以及类似盐析的争夺水化水现象2。等电点沉淀法利用具有不同等电点的两性电解质, 在达到电中性时溶解度最低, 易发生沉淀, 从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质, 可以利用此法进行初步的沉淀分离, 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白3, 而不用于沉淀目的物。非离子型多聚物是20 世纪60 年代发展起来的一类重要的沉淀剂, 它们具有很强的亲水性和较大的溶解度, 在溶液中可通过空间位置排斥作用使生物大分子、病毒和细菌等聚集沉淀。该法温和的操作条件和较高的沉淀效能, 使得其经常被用于细菌、病毒、核酸和蛋白质的分离, 其中应用最多的多聚物是聚乙二醇4,5。自Thomas Graham 1861 年发明透析方法至今已有140 多年, 透析已成为生物化学实验中最简便最常用的分离纯化技术之一, 在生物大分子的制备过程中, 除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术, 同时半透膜的材料也更加多样化、透析方式也更加丰富。超滤是一种加压膜分离技术, 自20 世纪20 年代问世后, 直至60 年代以来其发展迅速, 很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术6。超滤作为一种高效分离技术, 广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子的脱盐、浓缩和分级分离。溶剂萃取法( 是用一种溶剂将产物自另一种溶剂( 如水) 中提取出来, 以达到浓缩和提纯的目的) 是20世纪40 年代兴起的一项化工分离技术, 并很快应用到了生物分子的提取和分离上。最初是用于抗生素、有机酸、维生素等生物小分子的提取。最近几十年来随着与其它技术的结合而产生了一系列新的分离技术, 如逆胶束萃取、超临界萃取、液膜萃取等, 可以用于生物大分子如核酸、蛋白质、多肽等的提取和精制。3 现代分离方法3.1 色谱方法1903 年俄国植物学家Tswett, 在一填有碳酸钙的玻璃柱中注入用石油醚萃取的植物色素, 在室温下展层, 得到不同的色素区带, 后来称之为色谱7。色谱分离又称层析。最初, 层析技术并未得到关注。20 世纪50 年代, 气液层析得到发展, 并在石油、化工、制药等领域得到应用。到60 年代, 由于开发出适用于生物物质分离纯化的层析固定相, 层析技术才被用于生物物质的分离纯化并得到迅速发展7。至今, 已有丰富的色谱技术被用于生物大分子的分离。液相色谱法是分析化学中发展最快, 应用最广的分析方法, 它在许多领域成为必不可少的手段,其中高效液相色谱( high performance liquid chromatography,HPLC) 更是以其独特的优点占据突出地位。HPLC 用于生物化学样品分析始于20 世纪70年代中期, 80 年代针对生命科学领域分离和制备而设计的生物色谱填料为HPLC 在生命科学研究领域的地位奠定了坚实的基础; 90 年代, 随着生物医药研究与开发的迅速发展, 各种类型的高通量及手性色谱柱纷纷出现8。HPLC 是目前最通用、最有力和最多能的层析形式, 在生物大分子的分离分析中,HPLC 分离模式主要有反相色谱（ RPC) , 空间排阻色谱(SEC) , 离子交换色谱(IEC) , 疏水作用色谱(HIC) , 亲和色谱(AC)等。反相液相色谱柱效高、分离能力强、重复性好、操作简便、保留机理清楚, 是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种。它与多数其它形式的层析不同之处在于固定相基本上是惰性的, 固定相与被分离物之间只可能有疏水作用。它吸引人的地方在于流动相的小小变化, 例如加入盐, 改变pH 或有机溶剂的量就能成功地影响分离特性。它在20 世纪50 年代就已用于许多有机小分子的分离和分析,80 年代后逐步应用于生物大分子如蛋白质、多肽、核酸的鉴定,并用于制备规模的分离8。半个世纪前, 随着交联聚苯乙烯的出现和发展, 离子交换色谱成为一种重要的分离工具。离子交换色谱的填料及含盐的缓冲流动相系统类似于蛋白质稳定存在的生理条件, 有利于保持生物分子的活性和构象。因此, 它在解决生物学中许多难于分离的问题上起到了重大作用。随着HPLC 的飞速发展, 以及各种新型离子交换材料的出现, 离子交换色谱在氨基酸、蛋白质、核酸、有机酸、糖类及药物等方面的应用越来越广。空间排阻色谱所用的固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质凝胶, 是按溶质分子大小进行分离的色谱技术, 又称尺寸排阻色谱或凝胶色谱。按流动相类型不同分为凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱。十多年来该法在凝胶制备, 仪器技术性能, 数据处理和理论研究上取得的进展, 促进了该技术在许多领域的应用。亲和层析是60 年代发展起来的一种高效、快速的分离纯化技术。它是一种利用生物大分子能够通过范德华力、疏水力、空间和静电相互作用,与配体特异、可逆地结合在一起的生物学特性, 从复杂的生物样品中分离得到目标产物的液相色谱技术。亲和层析容量大, 选择性强, 分离效率高, 且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用, 最先被用于酶的纯化, 现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整细胞的纯化3。科学的发展使得分离分析的对象越来越复杂,从而提高了对分离分析技术的要求, 促进了各种新技术的发展。二维液相分离方法, 二维液相分离/ 质谱分析方法等多种自动化二维系统均得到了开发利用, 如Lundell 和Markides采用离子交换和反相色谱二维液相模式分离了复杂生物样品中的肽;Bushey 和Jorgenson设计了用阳离子交换和体积排除分离模式的自动化二维系统等。HPLC 与光谱或波谱技术的在线联用也成为了解决复杂样品体系的有力手段。目前最常用最有效的是高效液相色谱- 质谱(mass spectroscopy, MS) 联用技术, 高效液相色谱- 核磁共振( nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) 等也在研究开发中。与此同时,快速分离技术也得到了迅猛发展, 在20 世纪70 和80 年代需要1h 分离的样品现在可能只要几分钟甚至几秒钟即可完成, 有关快速HPLC 及其应用也多有报道, 如Unger 等最早采用缓冲溶液盐浓度梯度, 以4mL/min 流速在2.5min 内分离了8 种蛋白质。近年来, 随着生物技术和医药工业的发展, 传统的分离手段已经不能满足对大量样品高纯度分离的要求, 液相制备色谱的发展研究为解决实际应用中出现的问题带来希望。20 世纪70 年代初开发出的模拟移动床色谱具备分离能力强,设备体积小,投资成本低, 便于实现自动控制并特别有利于分离热敏性及难以分离的物系等优点, 在制备色谱技术中最适含用于进行连续性大规模工业化生产, 其应用范围也不断扩大, 已出现采用该技术分离氨基酸、单克隆抗体和蛋白质的研究17。超临界流体色谱( supercritical fluid chromatography,(SFC) 是以超临界流体( supercritical fluid, SF)作为流动相的一种新颖的色谱技术, 具有分析速度快、选择性好、分离效率高、分析条件温和等优点,可分析气相色谱不宜分析的高沸点、高分子量、低挥发性和热不稳定试样, 又比高效液相色谱有更快的分析速度和更高的柱效。自60 年代起逐渐出现一些有关该技术的研究报道。超临界流体色谱应用领域十分广泛, 可用于分离分析热敏性物质、非挥发性高分子、生物大分子、极性物质和手性对映体等。目前, SFC 与MS、FT- IR ( fourier transform infraredspectrometer, 傅里叶变换红外光谱仪) 、NMR等联用技术也逐渐得到开发。3.2 电泳技术及其它电泳现象于1808 年被发现, 在1937 年由瑞典科学家Tiselius A 首次将其作为一种分离技术所应用。随着电泳支持物的改进, 电泳条件的完善,区带电泳、等电聚焦电泳、双向电泳等技术逐渐建立起来。同时, 在电泳模式上也有了极大的发展, 先后出现了圆盘电泳、垂直板电泳、脉冲电泳等, 电泳分辨率也随之得到提高。1956 年Smithies 和Poulik最早引入双向电泳技术, 他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合起来分离血清蛋白, 随后双向电泳技术得到很快的发展。目前所应用的双向电泳体系由OFarrell 等于1975 年发明, 第一向为等电聚焦电泳, 第二向为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。这是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。该技术的应用与发展对开展“蛋白质组”的研究具有重要意义。同时,针对双向电泳技术的某些缺陷, 相应的改进技术也得以应用, 如窄范围pH 胶条的使用, 胶上差示电泳( differential in-gel electrophoresis, DIGE) 技术。然而, 由于蛋白质二维凝胶分离、染色体转移等环节操作困难, 且十分费时, 已被公认为是蛋白质组研究的技术“瓶颈”。因此, 发展快速、高效、高通量、在线的分离监督方法已成为蛋白质组学研究的重大科学问题之一。谁率先取得突破, 谁将占据蛋白质组学研究的有利地位。毛细管电泳( capillary electrophoresis, CE) 是20世纪80 年代初期迅速发展起来的一种新型分离分析技术, 是经典电泳技术和现代微柱分离有机结合的产物。与传统的分离方法相比, CE 具有分离效率高、分析速度快、样品及试剂用量少等特点, 使其成为极为有效的分离技术, 广泛应用于分离蛋白质、糖类、核酸等多种物质。目前, 不同分离模式的毛细管电泳技术已成为最重要的生物样品分离分析手段, 如毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚焦等。近来, 许多有关多维毛细管电泳分离技术的设想已被提出, 有些还得到了初步的尝试, 其分离的优势也得到人们的关注9。毛细管电色谱(CEC) 是利用电渗流或电渗流结合压力来推动流动相移动的一种液相色谱分离法。它集CE 和HPLC的优势与一身, 既有CE 水平的高柱效, 同时还具有HPLC 的高选择性。近年来其应用已引起广泛关注。目前, 毛细管电色谱的研究主要侧重于方法本身的完善和发展, 以及与质谱等定性分析技术联用的研究开发。微流控芯片于20 世纪90 年代初由瑞士的Manz 和Widmer 提出, 它是通过微细加工技术将微通道、微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件窗口和连接器等功能元件像集成电路一样, 使它们集成在芯片材料上的微全分析系统。近10 年来,随着微制造技术和电子技术的不断进步, 微流控芯片得到了迅速的发展, 并成为生物样品分离分析的重要手段和研究热点, 先后出现了毛细管电泳芯片、毛细管电色谱芯片、样品制备和分离的集成系统等。4 展望生命科学的发展决定了追求高效、快速、高通量、集成化的生物样品分离分析方法必将成为未来的发展方向。分子生物学中一个众所周知的事实是蛋白质生物活性和功能多是在溶液中显现的, 因此液相色谱的强大功能使得其在生命科学及其它领域的重要地位不会动摇, 面对复杂体系的分离任务, 它仍在不断完善发展。芯片系统将不断发展建立更多的实用体系, 开发更广泛的应用价值。多通道毛细管电色谱仪器也将被开发。对超临界流体性质的认识深入, 将推动超临界流体色谱技术的发展和应用。各种分离模式相结合构成的多维分离方法也将得到进一步的研究开发, 以实现将一根色谱柱上未分开的组分在另一根柱上用不同的分离原理加以完全分离。各种分离设备将与光谱、波谱这类提供结构信息的仪器进行在线连接, 建立起更多的联用方式, 以实现分离, 定性定量分