HBV分子诊断技术.pptx

乙肝病毒的分子分型方法 细胞生物学黄梁敏21620101152403 电镜下观察血清中的丹氏颗粒 上图 HBV感染型颗粒组分 下图 HepatitisB Thevirusanddisease 2009 小球形颗粒 直径22nm管形颗粒 22 40 400nm两者均为过剩的病毒外壳 仅含HBsAg 无感染性 Dane颗粒 42nm内含核酸 具有感染性 2 HBV基因组结构 pre s1 pre s2 S P C pre c X HBVDNA3 2kb HBVDNA 3 2KBpre S1pre S1蛋白pre S2pre S2蛋白SHBsAgpre CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAg HepatitisBvirusreplication2007 S区基因 包括S基因 PreS1和PreS2基因 分别编码HBsAg PreS1和PreS2Ag C区基因 编码HBcAg 还有一个PreC区可能在病毒核心和外壳的附着及结合中起作用 P区基因 最长 编码HBVDNA多聚酶 逆转录酶以及RNaseH X区基因 编码X蛋白 可以反式激活一些细胞的癌基因及病毒的基因等 可能与肝癌的发生有关 1988年Okamoto提出18株不同亚型的HBV基因序列两两比较后 根据核苷酸序列异源性 8 将18株HBVDNA序列分为A B C D4个基因型 HBV基因型的概念 Norder等对32例HBV患者S基因序列测序结果进行分析 除证实了Okamoto的结果外 还发现了2个新的基因型E F并发现S基因序列的变化同全基因序列的变化一致 A D和E型亲缘关系较近 而B和C型较近 HBV分型依据 HBV由双链环状DNA构成 长度约3 2kb迄今为止 根据HBV全基因核苷酸序列的异质性 8 或S区基因序列差异 4 将HBV分为A B C D E F G H8种基因型 分型的意义 通过HBV基因分型 可用于流行病学研究 了解HBV基因型的地区分布及各基因型致病性或毒力强弱情况 可观察基因型与抗病毒疗效关系 慢肝中C基因型比B基因型有更高的基础核心启动子 BCP 的突变率 B型对干扰素应答明显高于C型 尤以B型年轻患者疗效最好 可观察疫苗对HBV不同基因的预防作用 尤其对母婴传播基因型的研究 目前进行HBV基因型分型的方法主要有 1 单克隆抗体ELASA法 HBV基因组前S2区7种抗原决定簇的产物在不同基因型中有特异的组合 利用此原理制订单克隆抗体 并行辣根过氧化酶标记 该方法简单易行 但对混合感染和特异性表位存在突变时不能分型 目前进行HBV基因型分型的方法主要有 1 全基因或S基因序列分测定型法 全基因序列最为准确 可靠 但费用高 耗时长 操作复杂 不利于大规模调查研究Norder等发现单独使用S基因序列测定进行基因分型的方法 初步简化了基因分型的工序 于PCR方法的乙肝病毒基因分型常见的有三种 对S区的PCR RFLP法 对前S区的PCR RFLP法 和特异性引物的巢式PCR法 限制性内切酶长度多态分析法 PCR RFLP 这是目前使用得最多的分型方法原理是将各种基因型的HBVS基因或前S基因序列排列后比较 每种基因型有其独特的限制性内切酶位点 首先经PCR扩增出目标片断 然后用特定的限制性内切酶进行酶切 经酶切后产生不同的图谱 据此可区分不同的基因型 该方法应用最为广泛 其操作简单 费用相对低廉 适用于大量样本测定 特异性引物的巢式PCR法 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应 PCR 使用两对 而非一对 PCR引物扩增完整的片段 第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似 第二对引物称为巢式引物 因为他们在第一次PCR扩增片段的内部 结合在第一次PCR产物内部 使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增 优点 如果第一次扩增产生了错误片断 则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低 因此 巢式PCR的扩增非常特异 第一步 目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合 第二步 使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增 由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部 而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极