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欢迎各位专家光临 一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的实验研究 课题鉴定 验收资料汇编二00五年十二月 目录 一 一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的实验研究 课题摘要二 一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的实验研究 课题工作报告三 一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的实验研究 课题技术报告四 文献综述五 主要完成单位及完成人员六 科技查新报告七 已发表的论文八 附图 课题摘要 一目的 检测内皮型一氧化氮合酶 eNOS 和诱导型一氧化氮合酶 iNOS 在绒毛膜癌 子宫肌瘤 子宫颈癌及卵巢癌组织中的表达情况 探讨一氧化氮合酶在妇科肿瘤发生 发展中的作用 二方法 选取临床病理资料172例分为四组 其中子宫颈癌51例 绒毛膜癌24例 卵巢癌55例 子宫肌瘤42例 各组均采集其相对应的正常组织标本共计130例作为对照 子宫颈组织50例 绒毛组织22例 卵巢组织50例 子宫平滑肌组织8例 应用免疫组化的方法 观察eNOS iNOS在四种妇科肿瘤组织中的表达 三 结果 1 eNOS iNOS蛋白在四种妇科肿瘤组织中均有不同程度的表达 均显著高于其正常对照组织 2 eNOS iNOS蛋白在子宫颈癌组织中的表达与宫颈癌的病理分级有关 P 0 05 随着宫颈癌分级的升高而呈上升趋势 3 在子宫肌瘤中eNOS iNOS蛋白相比 eNOS的表达显著高于iNOS P 0 05 四结论 1 一氧化氮合酶蛋白的表达与四种妇科肿瘤组织有关 它们可能在四种妇科肿瘤的发生 发展中发挥着重要的作用 2 NOS可望成为早期诊断子宫颈癌的检测指标之一 也可望利用NOS抑制剂来治疗宫颈癌 把测定NOS作为判断宫颈癌细胞分化程度的一个参考指标 课题工作报告 一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的实验研究 一 课题研究的目的意义 肿瘤是危害人类生命健康极大的特殊疾病 目前全世界每年死于癌症的近1千万人 60 以上的患者在初次确诊恶性肿瘤的时候就已经发现有转移 因此 提出寻找肿瘤形成的原因成了世界所关心的课题 在女性生殖系统疾患中 妇科肿瘤的发生率占有一定的比例 严重威胁着广大妇女的健康 其中子宫颈癌 绒毛膜癌 卵巢癌 子宫肌瘤是比较常见的妇科肿瘤 这些肿瘤由于确切病因不明 发病机理不清 因而 临床治疗效果还不十分理想 因此 探讨肿瘤发生 发展的致瘤因素已具有十分重要的意义 近十多年来 随着分子生物学的飞速发展 使NO成为肿瘤病因学研究的热点 一氧化氮合酶 nitricoxidesynthase NOS 是催化一氧化氮 nitricoxide NO 生物合成的酶 也是内源性NO合成的关键酶 已知NOS按调节方式分为结构型一氧化氮合酶 cNOS 和诱导型一氧化氮合酶 iNOS 两种类型 其中cNOS又包括神经型一氧化氮合酶 nNOS 和内皮型一氧化氮合酶 eNOS 两种 cNOS为细胞本身所固有 在生理条件下受钙离子 钙调蛋白系统调节 合成少量NO 主要参与机体正常生理功能的维持 发挥调节血管口径 通透性 传递细胞信息等生物学作用 iNOS则主要存在于诱导活化的巨噬细胞 非依赖于钙离子 钙调蛋白系统 在生理条件下iNOS不表达活性 在乏氧 炎症 如细菌脂多糖LPS 细胞因子 TNF IL1 INF a等 作用下iNOS诱导生成NO NO产量大 具有重要的杀菌 抗病毒以及杀肿瘤细胞活性 参与了抗肿瘤免疫过程 NO可能促瘤生长作用的原因有三点 1 低氧上调iNOS表达 NO在内皮细胞中诱导有丝分裂 在癌细胞中诱导血管内皮生长因子的表达和促进肿瘤新生血管的形成 因此 NO促瘤生长作用原因之一可能与血管形成因子有关 2 NO是强有力的血管舒张剂 NO促瘤生长作用原因之二可能是NO及其产物引起肿瘤组织血流或血管通透性增加 血流的加快和血管通透性提高增加了肿瘤的养分和加快了代谢废物的清除 从而加快了癌细胞的生长和基质细胞的生长 3 NO还可以通过抑制免疫系统和促进局部组织的诱变性促进局部肿瘤的生长 因此 NO在肿瘤的发生 发展过程中起着重要的作用 本课题从蛋白水平上探讨了NOS在四种妇科肿瘤的发生 发展中发挥的作用 为将来利用NOS抑制剂防治妇科肿瘤提供理论基础 应用基因疗法彻底根治妇科肿瘤指明了方向 二 课题的内容 本实验共分4组 1 绒毛膜癌及对照组织46例 2 子宫肌瘤及其对照组织50例 3 子宫颈癌及其对照组织101例 4 卵巢癌及其对照组织105例每一蜡块连续切片3张 一张做HE染色 其余两张分别用于eNOS iNOS染色 免疫组织化学染色 采用常规的SP法 每次染色设置阳性 阴性对照 仔细观察每张切片中eNOS iNOS蛋白阳性细胞的表达及分布情况 仔细观察每张切片的病理特点 并且作好记录 最后进行统计学处理 三 技术路线及实施过程 一 标本来源及筛选全部妇科肿瘤及对照组标本均来源于甘肃省定西地区医院1993年3月 2002年10月 经手术切除并备有完整临床资料的病理科存档蜡块 共计302块 从中筛选出实验组标本172例 其正常对照组织总共130例 所有妇科恶性肿瘤患者术前未接受放疗 化疗或其它特殊治疗 子宫肌瘤患者术前三个月未服用过激素 二 临床病理资料 24例绒毛膜癌全部为妊娠性绒癌 临床分期为 期者9例 期者6例 期者6例 期者3例 42例子宫肌瘤中 病理组织类型为肌壁间子宫肌瘤者28例 浆膜下者7例 粘膜下者7例 51例子宫颈癌中 病理分级为 级者10例 级者16例 级者25例 临床分期为 期者18例 期者12例 期者9例 期者12例 55例卵巢恶性肿瘤中 组织类型为浆液性乳头状囊腺癌者16例 粘液性乳头状囊腺癌者19例 卵巢转移癌者14例 卵巢颗粒细胞癌者6例 三 药品与试剂 1 兔抗人NOS2多克隆抗体 BosterBiotechnologyComLTD2 兔抗人NOS3多克隆抗体 BosterBiotechnologyComLTD3 DAB显色试剂盒 福州迈新生物有限公司4 SP试剂盒 福州迈新生物技术开发公司 四 主要仪器和设备 1 光学显微镜及显微照相系统 日本Olympus公司2 切片机 德国产AQ8203 台式恒温震荡器 TH2 82A 上海跃进医疗器械厂4 台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂5 恒温孵箱 湿盒 微波炉等 五 实验方法 本实验共分4组 1 绒毛膜癌及对照组织46例 2 子宫肌瘤及其对照组织50例 3 子宫颈癌及其对照组织101例 4 卵巢癌及其对照组织105例 每一蜡块连续切片3张 一张做HE染色 其余两张分别用于eNOS iNOS染色 采用免疫化学染色法 即常规的SP法 仔细观察每张切片的病理特点 并且作好记录 每次染色设置阳性 阴性对照 六 结果判定标准 eNOS iNOS蛋白染色的阳性信号均为细胞浆内出现均匀一致或细颗粒状的棕黄色染色 根据阳性细胞数占细胞总数的百分比及显色强度分为4个等级 无阳性细胞或阳性细胞数极少 无色者为阴性 一 阳性细胞数50 呈棕黄色者为强阳性 七 统计学方法 将结果进行2 2或R C联表的x2检验或者四格表确切概率法 P 0 05为差异有显著性 统计应用SPSS10 0统计软件在微机上完成 四 课题的进度本课题共分五个阶段 一 第一阶段 2001 9 2001 10 进行文献检索 设计 制定研究课题 并阅读国内外相关文献 其中英文17篇 中文73篇 共计90篇 在此期间 撰写文献综述1篇 科研论文1篇 二 第二阶段 2001 11 2002 12 收集 筛选 确定了子宫颈癌 绒毛膜癌 卵巢癌 子宫肌瘤手术后标本172例及其对照组织130例 将这些标本进行登记制表 订购试剂 撰写技术项目申请报告 做预备实验及部分正式实验 三 第三阶段 2003 1 2003 2 继续做正式实验 对所选四种妇科肿瘤组织及其对照组织进行HE染色 eNOS iNOS蛋白的免疫组化染色 在光学显微镜下对染色结果进行仔细观察 并对每一例标本的染色结果做好详细的记录 制定统计图表 对实验数据进行统计学处理 四 第四阶段 2003 3 2003 4 撰写项目技术资料初稿 五 第五阶段 2003 5 2003 9 对初稿进行两次修改 审核定稿 打印技术项目申请报告 五 应用前景及社会经济效益分析 本课题采用细胞生物学检测技术 免疫组织化学 免疫组化 方法 从蛋白水平上探讨与这四种妇科肿瘤致瘤因素相关的指标 一氧化氮合酶 通过对一氧化氮合酶的两种同工酶eNOS iNOS进行检测 掌握它们在四种妇科肿瘤组织中的表达特点 进一步为临床防治这四种妇科肿瘤提供理论依据 也为将来应用基因疗法治疗这四种妇科肿瘤指明方向 有潜在的社会效益和经济效益 可望在不久的将来利用一氧化氮合酶的抑制剂治疗这四种妇科肿瘤 为临床新药的开辟提供方向 为妇科肿瘤患者的疾苦作出贡献 六 课题经费预算与用途 一 购买试剂 免疫组化试剂10000元 一般试剂4000元 二 复印及打印费 2000元 三 切片劳务费 4000元 五 技术项目评审费 2000元 六 其它 5000元 上述各项费用共计27000元 七 课题承担单位简况 定西市人民医院始建于一九五0年 经过五十年的发展 已成为医疗 教学 科研 预防 急救为一体的综合性医院 近年来 医院相继引进了美国GE 9800全身CT 德国西门子彩超等现代化医疗设备 拥有高中级专业技术人员160多人 参与了一项国家 八五 攻关课题 部分项目已达到全省领先水平 课题组成员简况 本课题技术指导王丽京教授 兰州大学生命科学院博士 兰州医学院硕士研究生导师 项目负责人陈芳兰同志系王丽京教授的硕士研究生 1989年从兰州医学院毕业 分配到定西市医院工作 2002年取得硕士学位 已具备承担科研项目的实力 于2004年12月晋升为妇产科副主任医师 其余主要完成人员名单依次如下 郭碧莲 1994毕业于兰州医学院 本科学历 1999年10月晋升为妇产科主治医师 李淑梅 孙风副主任医师 本科学历 还有师金梅 孟萍等4名同志参与 都具有丰富的临床经验和扎实的理论基础 以上同志均为妇产科的业务骨干 一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的实验研究 课题技术报告 一氧化氮合酶是催化内源性一氧化氮生物合成的关键酶 由于一氧化氮对肿瘤的影响具有致瘤及抗肿瘤的双向作用 故人们对一氧化氮合酶 一氧化氮的研究方兴未艾 近年来 有关NOS在体内外肿瘤组织中表达的研究报道很多 体外实验发现 一些动物肿瘤模型及人肿瘤系均有NOS表达 而且在人肝癌 脑肿瘤 肺鳞状细胞癌 食管癌 膀胱癌 乳腺及前列腺等的肿瘤中发现NOS活性增高 有关系统地研究NOS在四种妇科肿瘤组织中表达的研究报道却未见到 1 国内外研究现状 1 有人用分光光度计检测了42例卵巢肿瘤中NOS活性 显示卵巢恶性肿瘤的发生与NOS的活性有关 且NOS随分化程度的降低而呈升高趋势2 Sanyal等采用免疫细胞化学的方法检测了绒癌细胞株 JEG 3 及正常位置胎盘滋养细胞中NOS的表达 结果显示eNOS iNOS完全缺如 只有nNOS存在 其原因可能是Sanyal等研究的是体外培养的绒癌细胞株的缘故 国内目前尚未发现一篇有关NOS与绒癌相关的研究报道 有关NOS与子宫肌瘤的研究报道亦未见到 2 关键技术 2 1HE切片形态学观察 实验的每一蜡块连续切片3张 一张做HE染色 其余两张分别用于eNOS iNOS染色 仔细观察每张切片的病理特点 并且作好记录 2 2免疫组织化学染色 每次染色设置阳性 阴性对照 采用常规的SP法 具体方法如下 1 切片650G烘烤72小时后浸入新鲜二甲苯15min 2 2 梯度酒精各5min至水 3 0 01mol LPBS洗5min 3 4 3 H2O2封闭内源性过氧化酶10min 5 PBS洗5min 3 6 加入复合消化液置370G恒温箱15分钟 以充分暴露组织中的抗原 7 PBS洗5min 3 8 正常山羊血清封闭细胞中非特异性抗原 减少非特异性着色 室温下孵育10分钟 PBS洗一次即可 9 加入第一抗体兔抗人NOS2 NOS3多克隆抗体 温盒内40G冰箱过夜 10 40G冰箱取出后 室温下复温1小时 11 PBS洗5min 3 12 加生物素标记的第二抗体 室温下孵育10分钟 13 PBS洗5min 3 14 加入链霉素抗生物素蛋白 过氧化酶溶液 室温下孵育10分钟 15 PBS洗5min 3 16 加入新鲜配制的3 3 二氨基苯二胺 DAB 底物溶液 室温避光显色30 40分钟 镜下控制反应时间 流水冲洗终止反应 17 苏木素复染 自来水冲洗 盐酸酒精分化数秒 18 自来水冲洗 梯度酒精脱水 二甲苯透明 中性树胶封片 2 3 对照观察 1 阴性对照 用PBS代替一抗作为阴性对照 2 阳性对照片由武汉博士德公司提供的乳腺癌阳性片 3 技术研究的内容 3 1一氧化氮合酶在绒毛膜癌及正常绒毛组织中的表达 统计学分析显示 绒毛膜癌组与对照组间eNOS蛋白阳性表达率有显著性差异 2 5 122727 P 0 05 镜下可见eNOS蛋白表达主要位于细胞浆 呈棕黄色 如下表1 组别例数eNOS表达阳性率 对照组221840018 18绒毛膜癌241247150 00 iNOS蛋白表达也位于细胞浆 只是染色强度较弱而已 阳性情况见表2 统计学分析显示 绒毛膜癌组与对照组间iNOS蛋白阳性表达率有显著性差异 2 5 517919 P 0 05 表2组别例数iNOS表达阳性率 对照组22211004 55绒毛膜癌241590037 50 3 2一氧化氮合酶在子宫肌瘤及正常平滑肌组织中的表达 在子宫肌瘤组织中 eNOS阳性表达的细胞主要分布在肌瘤组织的中央 呈局灶性分布 其染色较强 呈棕黄色细颗粒状 iNOS的分布特点基本类似于eNOS 只是染色强度较弱 结果见表3表3组别例数eNOSiNOS阳性数阳性率 阳性数阳性率 子宫肌瘤组423583 332559 52正常对照组8225 00112 50X2值9 0464 218P值 0 005 0 05 35例eNOS阳性表达的子宫肌瘤组织中 iNOS阳性表达者为25例 经统计学处理 两者有显著的相关性 P 0 05 见表4 表4eNOSiNOS合计阳性阴性阳性251035阴性167 3 3一氧化氮合酶在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达 eNOS蛋白阳性的细胞主要分布于癌巢组织中 呈强阳性表达 免疫细胞无eNOS蛋白阳性表达 iNOS阳性的细胞分布基本与eNOS蛋白的一致 只是表达强度较弱而已 eNOS iNOS在子宫颈癌组织的表达率明显高于其正常对照组织 P均 0 01 见表5表5组别例数eNOS表达iNOS表达 阳性率 阳性率 宫颈癌组5168112688 2310278680 39对照组5030155040 004073020 00 在不同病理分级中 经RXC联表的x2检验 eNOS iNOS各组间比较P均0 05 具体结果见表6 表6类型例数eNOS表达强度iNOS表达强度 病理分级G1 G2266351291043G3250561411743临床分期 期 期304581361554 期 期212331341232 3 4一氧化氮合酶在卵巢癌组织及正常卵巢组织中的表达 检测显示 eNOS iNOS蛋白表达在卵巢癌组织中均明显高于正常对照组织 P均0 05 结果见表7表7类别例数 eNOS iNOS阳性率 阳性率 对照组505 10 00 0 0 卵巢癌组5540 72 73 25 45 46 组织类型浆液性乳头状囊腺癌1613 81 25 9 56 25 粘液性乳头状囊腺癌1911 57 89 6 31 58 卵巢转移癌1410 71 43 6 42 86 卵巢颗粒细胞癌66 100 00 4 66 67 技术研究结论 4 1绒毛膜癌组研究结论 eNOS iNOS蛋白的高表达与绒毛膜癌的发生 发展有关 它们可能在绒毛膜癌的发病机制中发挥一定的作用 eNOS iNOS在早孕正常绒毛组织中的弱表达 说明由它们催化生成的NO量较少 这些NO可能与早孕正常绒毛组织的生理功能有关 eNOS iNOS在绒毛膜癌组织中的高表达 间接反映了滋养叶细胞中生成的NO含量较高 这些NO可能通过某些途径发挥了致瘤与促瘤生长的作用 至于通过哪条途径发挥作用 值得进一步探讨 4 2子宫肌瘤组研究结论 结果说明eNOS和iNOS的过表达与子宫肌瘤的发生 发展有关 它们可能在子宫肌瘤的发病机制中起一定的作用 本研究还显示eNOS与iNOS的阳性表达相比 二者有显著的相关性P 0 05 这说明eNOS和iNOS在子宫肌瘤组织中的表达呈同步性 两者参与肌瘤细胞的增殖与分化 导致肌瘤的发生 发挥协同作用 且eNOS的作用大于iNOS的作用 在正常子宫平滑肌组织中eNOS和iNOS的弱表达 说明这些较少的NO可能与平滑肌细胞的正常生理功能有关 NOS在子宫肌瘤组织中的高表达间接反映了肌瘤细胞中生成的NO含量较高 但NO和NOS究竟是通过哪条途径促进子宫肌瘤的发生 发展 还有待于进一步探讨 4 3宫颈癌组研究结论 研究说明eNOS iNOS的表达与宫颈癌的发生 发展有关 eNOS iNOS在宫颈癌组织中的异常表达 表明了宫颈癌局部组织中由两种NOS催化诱导合成的NO量较多 这些高水平的NO可能非但不能发挥抗肿瘤活性 反而促进了宫颈癌细胞的增殖与分化 从而促进了肿瘤细胞的生长 发挥了致瘤和促瘤生长作用 利用NOS在宫颈组织中的表达特点 我们可以将NOS作为将来早期诊断宫颈癌的检测指标之一 也可以利用NOS抑制剂来治疗宫颈癌 本研究的结果还表明eNOS iNOS的表达与宫颈癌的临床分期无关 P 0 05 与宫颈癌的病理分级有关 P 0 05 随着宫颈癌病理分级的升高而呈上升趋势 这说明eNOS iNOS与肿瘤细胞的分化程度有关 分化越差的肿瘤细胞NOS的表达越强 我们可以把测定NOS作为判断宫颈癌细胞分化程度的一个参考指标 4 4卵巢癌组研究结论 eNOS iNOS在卵巢恶性肿瘤组织中的表达均明显高于正常卵巢 P均0 05 这表明eNOS iNOS仅仅参与了卵巢癌的发生 发展过程 在决定卵巢癌的