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文档简介

木瓜蛋白酶的提取1、 实验内容与目的从青木瓜中提取木瓜蛋白酶,用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。通过本实验,掌握天然活性化合物的提取和蛋白质浓度的测定技术。2、 实验原理(1) 木瓜天然酶木瓜蛋白酶(papain),简称木瓜酶,又称为木瓜酵素。他是一种含硫基(SH)肽链内切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,有较广泛的特异性,对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力,同时,它还具有合成功能,能把蛋白质水解物合称为蛋白质。木瓜蛋白酶溶于水和甘油,水溶液无色或淡黄色,有时呈乳白色;几乎不溶于乙醇。氯仿和乙醚等有机溶剂。其最适pH为5.7(一般39.5皆可),在中性或偏酸性时亦有作用,等电点18.75;最适温度为5560(一般1085皆可),耐热性强,在90时也不会完全失活;受氧化剂抑制,受还原性物质激活。木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜(Carica papaya)茎叶和果实中,以未成熟果实的乳汁中为最高。提取未成熟的番木瓜果实中的乳汁,采用现代生物工程技术提炼可得纯天然生物酶制品。(2) 考马斯亮蓝结合法(Bradford法)测定蛋白质浓度的原理在一定范围内,考马斯亮蓝G250蛋白复合物呈色后,在595nm下,吸光度与蛋白质含量关系呈线性关系,故可以用蛋白质浓度的测定。3、 实验材料1.材料青木瓜2.试剂氢氧化钠、磷酸、考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、95%乙醇3.主要仪器设备离心机、磁力搅拌器、刀片、电子天平、紫外可见分光光度计、冰箱、pH计。4、 实验步骤(1) 木瓜蛋白酶的提取(1) 用薄不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜过时的纵线将果皮割破,深度为23nm,根据果实大小的不同,每个果实可以切510条刀口。(2) 将木瓜放于一个大烧杯中,适度挤压木瓜,使木瓜乳汁流入大烧杯中。(3) 将手机的乳液按1:1量加入蒸馏水,搅拌1h,用NaOH将pH调至9.0。(4) 将乳液用离心机在3500r/min的条件下,离心15min。(5) 收集上清液至另一洁净的烧杯中,得木瓜蛋白酶粗酶液,测量其体积,冰箱中保存备用。(2) 蛋白质浓度的测定1. 配置试剂1) 考马斯亮蓝实际的配置考马斯亮蓝G250(0.01%):称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇中,再加入100ml浓磷酸(质量百分浓度为85%),然后加蒸馏水定容到1L。2) 标准蛋白夜的配置牛血清白蛋白(0.1mg/mL):准确称取牛血清白蛋白0.02g,用蒸馏水溶解并稀释到200mL.2. 绘制标准曲线取7支洁净干燥的试管,按表9-1进行编号,并加入各种试剂。将其混匀,室温静置5min。以第1管为空白,于波长595nm处比色,读取吸光度(OD595)。表9-1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度标准曲线制作管号1(空白)234567标准蛋白液/mL00.10.20.30.40.60.8蒸馏水/mL1.00.90.80.70.60.40.2考马斯亮蓝染液/mL4.04.04.04.04.04.04.0蛋白质浓度/(g/mL)0102030406080OD5953. 样品液的测定 将(一)中步骤(5)所得木瓜蛋白酶粗酶液进行适当的稀释(样品蛋白质含量以在10100g为宜),取1.0mL,加入试管中,再加入4mL考马斯亮蓝G250,立即摇匀,室温静置5min,然后用分光光度计测595nm波长处吸光值(OD595)。5、 实验讨论与注意事项(1) 木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜茎叶和果实中,以未成熟过时的乳汁中为最高。因此,选取的材料应是未成熟的木瓜。(2) 木瓜蛋白酶易受热失活或化学药品引起失活,所以在制备过程中要求低温、短时、卫生、忌碱、忌强酸作用。勿与铁、铜等接触。 (3)木瓜蛋白酶是一种水解酶,对人体皮肤有刺激分解作用,所以在制备时请做好相应的保护工作。 (4)样品蛋白质含量以10100g为宜。一些阳离子如K+、Na+、Mg+以及乙醇等物质对测定无影响,而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定。6、 实验结果记录与数据处理(1)记录不同浓度标准蛋白质溶液对应的吸光值(OD595),记入表9-1中。(2)根据表9-

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