金银花提取.doc

金银花中总黄酮化合物的提取及其抑菌活性的初步研究材料化学专业 张雪峰指导教师 于曙光摘要: 为了获得具有抑菌活性的黄酮类化合物，本文以金银花为实验材料，以乙醇为溶剂分别采用索氏提取、微波、超声波三种方法在不同的条件下从金银花中提取总黄酮得到一系列的粗提物，通过紫外可见分光光度法对其吸光度进行测定,计算出其中总黄酮的含量和产率，通过比较得出如下结论：乙醇浓度70%，在700W的功率下用微波提取法提取5min，此条件下提取得到的黄酮含量最高。另外，本实验利用滤纸片法对提取得到的黄酮进行了抑菌活性的初步研究，结果表明，在浓度为0.381mg/ml时，金银花中黄酮对大肠杆菌具有较强的抑制作用（平均抑菌圈直径为9mm），当浓度降低时，抑菌效果明显减弱。当浓度为0.00381mg/ml 时，基本看不到抑菌效果。另外对黄酮粗提液进行定性检测发现：提取液中还含有少量的酚类、多糖类、蛋白质、生物碱等物质。 关键词：金银花；微波法；抑菌活性；黄酮提取物； The Research on Extraction of Flavonoids from Flos Lonicerae and its Antibacterial activity Student majoring in Marearial Chemistry Li Xiaoyun Tutor Yu ShuguangAbstract: In order to extract flavonoids which have antibacterial activity, the flos lonicerae were used as material and ethanol as solvent, with Soxhlet, micro-wave and ultrasonic methods to extract flavonoids. According to the absorbance of extracts measured by the Ultraviolet-Visible Spectrophotometer, the results showed that the methods with the 70% ethnol as solvent, the microwave at 700w and 5 minutes is of the best efficiency. In addition , in the research on antibacterial activity ,the results showed that when the concentration of extracts is 0.381mg/ml , we can observe visible inhibition effects on Escherichia coli ( the average dm of the antibacterial cirle is 9mm ), with the concentration decreasing ,its antibacterial activity decreased. When the concentration is 0.00381mg/ml , it hardly had no antibacterial activity .With the qualitative analysis, We found that extracts of different Solvent have different contents including Phenol, polysaccharides, proteins, alkaloids and flavonoids.Key words: Flos Lonicerae ; micro-wave technique; antibacterial activity ; extract of flavonoids1 引言金银花，又名二花，为忍冬科忍冬属植物忍冬的干燥花蕾或初开的花，在我国大部分地区均有生产，是我国传统中药材，味甘、性寒、清热解毒、凉散风热。现代化学分析和药理实验证明，金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫及解热抗炎、利胆、保肝、降脂、抗生育、止血、抗溃疡等药理作用。据报道，全国有20余种植物的花蕾当金银花入药1， 皆为忍冬科忍冬属植物。由于具有特殊药效，因此成为近年来中草药的研究热点。金银花中含有木犀草素、异绿原酸、绿原酸和黄酮等多种化合物，传统认为绿原酸是金银花的主要有效成分，但根据现代医学研究表明，其中的黄酮类化合物具有降低心肌耗氧量，使冠脉、脑血管流量增加，抗心律、软化血管、降血糖、血脂等作用2，同时它还是一种天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基抗衰老，增加机体免疫力的生理活性作用，因此其生物活性日益成为人们研究的热点。本文分别采用索氏提取法、超声波法以及微波法对其中的黄酮化合物进行浸提，研究金银花中黄酮类化合物的最佳提取工艺及条件，并且对其粗提物的抑菌活性进行了研究，为金银花中有效成分的提取以及生物活性的探究提供理论基础。1.1 金银花中的化学成分研究现状金银花因其独特的药用价值引起了人们的关注，近年来有人对金银花的化学成分作了一些研究，其中对忍冬的论述较多，根据对金银花化学成分的研究表明，其富含挥发油，此外含黄酮类、三萜类及有机酸等。1.1.1 挥发油成分挥发油成分作为有效成分之一，忍冬的干、鲜花和枝藤中均含挥发油。虽然不同产地不同品种的鲜金银花挥发油所含化学成分的种类及所占比例有所不同，差异表现不明显，但干、鲜花成分差异较大。鲜花挥发油成分以芳香醇为主，其他多为低沸点不饱和萜烯类成分；而于花挥发油以棕榈酸为主，一般占挥发油的26.00以上，芳香醇含量仅在0.39以下3。对不同部位挥发油成分进行了分析比较，从花和枝藤中共分离鉴定出36种成分，相对含量较高的成分均为棕榈酸和亚油酸，二者之间的成分具有高度相似性4。1.1.2 黄酮类化合物日本研究者首先从金银花中分离出了木犀草素和忍冬苷。1995年，高玉敏等从金银花中分离出8种黄酮类化合物，经鉴定为木犀草素、7-o-廿D、葡萄糖苷、木犀草素、半乳糖苷、槲皮素、o-p-D-葡萄糖苷和金丝桃苷5。黄雄等高效液相色谱法同时证明了不同种金银花中含有多种黄酮类成分6。1.1.3 有机酸类绿原酸类化合物是金银花的主要有效成分，包括绿原酸和异绿原酸，其中异绿原酸为一混合物7，它的异构体有7种，分别为4，5-二咖啡酸酰奎尼酸，3，4一二咖啡酸酰奎尼酸，3，5一二咖啡酸酰奎尼酸，1，3-二咖啡酸酰奎尼酸，3一阿魏酰奎尼酸，4一阿魏酰奎尼酸，5一阿魏酰奎尼酸。其它有机酸还有咖啡酸及棕榈酸8。1.1.4 三萜皂类化合物1990、1994年，陈敏等分别从金银花中依次分离出1种含有6个糖基的三萜皂苷和2种新的双咖啡酰基奎尼酸酯化合物。茅青等也分别分离出3种三萜皂苷9。1.1.5 无机元素类研究分析表明，金银花中含Fe、Mn、Cu、Zn、Ti、Sr、Mo、Ba、Ni、Cr、Pb、V、Co、Li、Ca等15种微量元素10。1.1.6 其他 忍冬花蕾中还含有肌醇、-谷甾醇11。1.2 金银花的药理作用金银花性寒，味苦，金银花及其其它同属植物药理作用研究表明，其具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫及解热抗炎、利胆、保肝、降脂、抗生育、止血、抗溃疡等药理作用。主治风热感冒、咽喉肿痛、腮腺炎、胆道感染、急慢性炎症、菌痢、肠炎等。1.2.1 抑菌、抗病毒作用金银花对多种致病菌均有一定的抑制作用，其中金银花提取物中绿原酸和黄酮类化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、青霉、黑曲霉、黄曲霉和酿酒酵母等均有一定的抑制作用。孙廷波等12对金银花水提取液对口腔病原性微生物体外抑菌实验表明，金银花水提液对引起龈病的变形链球菌，放射粘杆菌及引起牙周病的产黑色素类杆菌，牙龈炎杆菌及半放线嗜血菌均显示较强的抑菌活性。用金银花提取液对不同浓度血清型变形球菌进行实验，结果显示最低抑菌浓度在25 mg/ml以下者占958，而且最低杀菌浓度一般明最高于抑菌浓度，因此研究亦证明金银花提取液是抑菌作用。关于金银花抑菌有效成分一般认为是绿原酸类化合物。金银花水煎剂( 1: 20) 在人胚肾原代单层上皮细胞组织培养上, 对流感病毒、弧缓病毒、疱疹病毒均有抑制作用, 能抑制病毒的复制、延缓病毒所致细胞病变的发生。金银花在细胞外抑制柯萨奇及埃柯病毒的作用很明显。在预防与治疗非典型性肺炎(SARS ) 的中药配方中, 金银花也是主要成分之一8，在抗击“非典”中发挥了重要的作用。另外，金银花还有一定的抗猴免疫缺陷病毒(SIV) 的作用,对抗艾滋病病毒(HIV)亦显示中等活性13。1.2.2 抗氧化性刘昌平等14分别对于金银花中黄酮化合物在猪油中的抗氧化作用以及此类物质抑制亚油酸过氧化作用进行测定。其中在猪油中的抗氧化作用研究表明金银花中黄酮类化合物对猪油的氧化具有明显的抑制作用。这主要是因为黄酮类化合物具有多酚结构，能够提供活泼的氢质子与油脂氧化产生的自由基结合成稳定的产物，从而阻断油脂的自动氧化过程。同时，其提取物对O2 ,OH自由基的消除有明显的效果。而金银花中黄酮类化合物抑制亚油酸的过氧化作用是基于不饱和脂肪酸的自由基反应。反应过程中产生过氧化自由基，进而氧化生成环氧化物，环氧化物生成丙二醛，丙二醛与TBA作用生成TBA染料，其最大吸收波长为532 nm。因此，可以根据生成TBA染料的多少反映了532 nm处吸光度值的大小，是衡量自由基链反应进程的标志。抗氧化剂可抑制自由基链反应，最终表现为TBA染料生成较少，吸光度值变小。其最终研究表明，金银花黄酮类化合物具有明显的抗氧化活性，可除去猪油中的过氧化物。且在一定浓度范围内，金银花黄酮类化合物用量越大，纯度越高，其抗氧化效果越好。另外，金银花黄酮类化合物在亚油酸系中的抗氧化效果较猪油中明显。金银花黄酮类化合物具有用量少、安全无毒等优点。1.2.3 解热消炎作用对金银花解热，抗炎，免疫等实验研究结果表明，其水煮液，口服液和注射液对角叉胶，三联菌苗致热有不同程度的退热作用，对蛋青，交叉菜胶，二甲苯所致水肿有不同程度的抑制作用，另外还能明显提高下鼠腹腔巨噬细胞吞噬巨红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，从而证明临床作为清热解毒治疗感染性急病主要是通过调节机体免疫功能而实现的。李希贤等15利用金银花提取液对三联菌苗、角叉菜胶的致热有不同程度的退热作用，对蛋清、角叉菜胶、二甲苯所致足水肿亦有不同程度的抑制。其还能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬巨红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，为临床将金银花作为清热解毒治疗感染性急病主要是通过调节机体免疫力功能的推测提供了有力依据。罗中华等16利用金银花水提液能显著促进白细胞的吞噬功能，使受损淋巴细胞抗体产生能力显著增强。小鼠腹腔注射金银花注射液也有明显促进炎性细胞及吞噬细胞功能的作用，使烫伤小鼠免疫受抑状态有不同程度的好转。金银花抗炎作用的有效成分尚不明确，但黄褐毛总忍冬皂苷具有显著的抗炎活性。韩国的Lee20,21亦报道了2种单体的抗炎止痛作用。1.2.4 保肝、利胆作用动物实验表明，金银花中的三萜皂苷对CCI。引起的小鼠肝损伤有明显的保护作用。并明显减轻肝脏病理损伤的严重程度，是肝脏点状坏死数总和及坏死改变出现率明显降低。娄红祥等从金银花水溶性部分中分离得到3 个具有保肝活性的三萜皂苷, 对CC14 引起的小鼠肝损伤有明显的保护作用。黄褐色金银花总皂苷能明显对抗CCl4 , 对乙酰氨基酚及D - 半乳糖胺所致肝中毒小鼠血清明显降低。黄褐毛金银花总皂苷还对铬所致小鼠急性肝损伤亦有明显的保护作用，其作用机制在于诱导肝脏合成大量金属琉基蛋白（MT）,MT 结合镉于细胞浆中从而减少锡在核、线粒体、徽粒体及细胞浆中高分子蛋白质中的分布,由此减轻镉对肝细胞的毒性。另外, 对醋氨酚所致小鼠急性肝损伤也有明显的保护作用, 其作用机制可能是通过抑制细胞色素P一450药酶代谢系统, 诱导肝脏葡萄糖醛酸结合酶活性, 增强醋氨酚葡萄糖醛酸结合代谢, 从而加强醋氨酚在体内的解毒代谢, 减少醋氨酚毒性代谢产物而实现的17。1.2.5 止血作用金银花炭水液，混悬液具有显著的止血作用，且混悬液的作用强于不煎液。金银花炭中鞣质的含量仅为生品的0.5，且其止血作用却明显高于生品。1.2.6 降血脂作用潘竞锵等研究金银花及与茵陈蒿混煎液对血糖和血脂的作用和作用机制。结果表明, 金银花及金- 茵合剂对正常小鼠、高脂小鼠血糖未见明显影响; 防治性结药, 则能抑制四氧嘧啶所致血糖升高。本实验证明金银花能降低多种模型小鼠的血清胆固醇、动脉硬化指数, 提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL- C) 含量; 金- 茵合剂也有类似效应, 金银花能调节内、外源性血脂代谢紊乱。1.2.7 对月经过多、子宫功能性出血亦有良好止血作用。1.2.8 具抗生育作用。1.2.9 所含木犀草素具有止咳祛痰、平喘作用。1.3 抑菌、抗病毒作用进展1.3.1 抑菌作用一般认为，金银花的抗菌有效成分为绿原酸，且常以绿原酸的含量高低来评价金银花质量的好坏。研究表明，金银花叶中的绿原酸含量低于花，而它的抗菌效果却比较高，这意味着绿原酸可能不是金银花中唯一的抑菌成分22。根据对金银花中的总黄酮含量及其抑菌活性进行过测定，发现黄酮的抑菌活性高于绿原酸。根据赵彦杰等18对金银花叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、青霉、黑曲霉、黄霉和酿酒酵母等抑制作用的研究，粗黄酮对供试菌均有一定的抑制作用，但对黑曲霉、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，其次是黄曲霉、青霉、酿酒酵母和枯草芽胞杆菌，对鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用较弱。1.3.2 抗病毒作用金银花的抗病毒作用有广泛的应用前景, 由于其成分的复杂性和多样性, 其抗病毒机理的研究尚需设计更为精确的定量试验, 并对更多的单体化合物的药理及药效作用进行研究。近年来, 分子技术在研究金银花的理化成分及遗传多样性上应用越来越广, 如用5SRNA 基因间区序列变异来研究金银花药材道地性, 用HPLC 法测定不同生长期金银花中绿原酸的含量等19。这对金银花有效成分及抗病毒机理的研究具有指导意义, 有利于金银花的进一步开发和利用。本实验采用金银花作为原料，对其分别进行索氏提取、超声波提取以及微波提取，并且对其提取物的抑菌活性进行研究，旨在寻找最佳的提取方法并且找到具有抑菌活性的天然存在的化合物，为以后的提取以及医药、农药和保健产品的开发提供新的化合物合成模板做一些基础性的研究。2 材料与方法2.1 供试材料2.1.1 供试植物材料金银花（山东产） 经万能粉碎机处理成粉末待用2.1.2 供试化学试剂表2-1实验所用试剂清单实验试剂试剂纯度试剂生产厂家无水乙醇分析纯（AR）莱阳康德化学有限公司亚硝酸钠分析纯（AR）天津厚迪化工有限公司硝酸铝分析纯（AR）天津市巴斯夫化工有限公司氢氧化钠分析纯（AR）莱阳康德化学有限公司碘化钾分析纯（AR）天津市大茂化学试剂厂镁粉盐酸-萘酚浓硫酸水合茚三酮分析纯（AR）分析纯（AR）分析纯（AR）分析纯（AR）分析纯（AR）青岛化学试剂厂 莱阳康德化学有限公司天津厚迪化工有限公司烟台三和化学试剂厂天津市巴斯夫化工有限公司2.1.3 供试生化试剂LB Medium（Powder） 生化试剂 生工生物工程（上海）有限公司2.1.4 提取仪器与设备表2-2提取实验所用仪器清单仪器名称仪器型号生产厂家高速万能粉碎机FW-100型天津泰斯特仪器有限公司电子天平AR1140型奥豪斯国际贸易（上海）有限公司电热套KDM型龙口市先科仪器公司循环水式真空泵SHB-III型郑州长城科工贸有限公司超声波细胞粉碎机JY92-型宁波新芝生物科技股份有限公司微波催化合成/萃取仪XH-100A型北京祥皓科技发展有限公司2.1.5 供试菌种大肠杆菌 （Escherichia coli）2.1.6 抑菌实验仪器与设备表2-3抑菌实验所用仪器清单仪器名称仪器型号生产厂家立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50A型上海博讯实业有限公司医疗设备厂电子分析天平FA640A型上海精工电子仪器有限公司振荡培养箱HZQ-F160型哈尔滨市东联电子技术开发有限公司海尔微波炉MK-2270M型青岛海尔微波制品有限公司Haier冰箱BCD-185F型海尔电器有限公司超纯水机CASCADA IX M型上海精工电子仪器有限公司2.2 实验方法2.2.1 实验路线（1）金银花索氏提取金银花粉和溶剂索氏提取法过滤浓缩定容（2）金银花超声波提取金银花粉和溶剂超声波提取法过滤浓缩定容（3）金银花微波提取金银花粉和溶剂微波提取法过滤浓缩定容（4）提取液抑菌活性的初步研究金银花粉末微波提取液培养皿灭菌配制带毒培养基接种菌种活性筛选（5）化学成分定性分析提取液放入试管相应试剂滴加后颜色变化记录2.2.2 实验步骤2.2.2.1 提取2.2.2.1.1 金银花预处理山东临沂平邑产金银花，采摘后于背阴处风干。剪碎后，在万能粉碎机的作用下，粉碎至均匀粉末状并密封保存，置密闭容器阴凉干燥处储藏，以备使用。2.2.2.1.2金银花索氏提取该方法采用不同浓度的乙醇溶液在相同浓度下对金银花粉末进行萃取，比较其萃取效率。具体操作为分别称取4g金银花粉装入圆底烧瓶中，加入150ml的不同浓度的乙醇溶液，组装索氏提取装置，加热回流，虹吸3次左右将提取液过滤得到的滤液浓缩至大约40ml左右，待浓缩液冷却后转移到50ml容量瓶中，用所用浓度的乙醇溶液定容至50ml，分别对提取液进行标记。实验条件为乙醇浓度分别为20%，40%，60%，70%，80%。2.2.2.1.3 金银花超声波提取该方法采用不同的超声条件对金银花进行超声提取，分别以超声功率、超声时间以及间隙时间为变量进行实验条件的设定来进行萃取比较其萃取效率。具体操作方法为称取4g金银花粉装入碘量瓶中，加入150ml的70%乙醇提取液，分别设定超声功率、超声时间、间隙时间，其中工作次数定为60不变，在碘量瓶安装完毕后开始提取至超声波细胞粉碎机工作停止。将提取液过滤，将过滤得到的滤液浓缩至大约40ml左右，待浓缩液冷却后转移到50ml容量瓶中，用70%乙醇定容至50ml，分别标记提取液。实验条件如下表，编号123456实验参数设定200w，5min，10min200w，10min，10min300w，5min，10min300w，10min，10min400w，5min，10min400w，10min，10min2.2.2.1.4 金银花微波法提取该法采用不同的微波工作条件对金银花粉末进行提取，以工作功率以及工作时间为变量进行实验，其中实验温度经过参考文献定为70，其主要原因可能是当温度太低达不到反应条件时，黄酮难以从金银花叶中解离出来。但温度太高则可能发生黄酮的分解或与其它杂质发生反应，影响了黄酮的提取，本实验温度不作为变量来进行讨论，比较在不同条件下的提取效率以得到最优的提取方案。具体操作方法为称取4g金银花粉装入四口瓶中，加入150ml的70%乙醇提取液，放入磁子，插入温度传感器，接通冷凝水，设定微波工作参数：工作功率，工作时间，工作温度为70，开始提取至微波萃取仪工作停止。将提取液过滤，将过滤得到的滤液浓缩至大约40ml左右，待浓缩液冷却后转移到50ml容量瓶中，用70%乙醇定容至50ml，分别对提取液进行标记。实验条件如下，编号123456实验参数设定600w5min600w10min700w5min700w10min800w5min800w10min2.2.2.2 金银花提取液中总黄酮含量的测定2.2.2.2.1 溶液的配制分别配制质量比为1:20的亚硝酸钠水溶液和质量比为1:10的硝酸铝水溶液，并且配制质量分数为10%的氢氧化钠溶液，体积分数为30%的乙醇溶液。2.2.2.2.2测定方法本实验以芦丁为对照品，采用分光光度法测定提取物中黄酮类物质的总含量。分别精密吸取样品溶液1ml，至于25ml容量瓶中，先加入10.0ml 30%乙醇溶液，0.7ml NaNO2溶液，摇匀，放置5min；加0.7ml Al(NO3)3溶液，摇匀，放置6min，再加入10%NaOH溶液5.0ml，用30%乙醇定容，摇匀，放置10min，在510nm处测定吸光度。2.2.2.2.3芦丁标准工作曲线的绘制精密称取芦丁适量，加80%乙醇溶解，制成0.1mg/ml的对照品溶液。精密吸取芦丁对照液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，按照上述测定黄酮的方法测定吸光度，绘制标准曲线。表1 不同芦丁浓度的吸光度编号体积浓度吸光度100021.00.100.09032.00.200.18043.00.300.29154.00.400.38965.00.500.484以测定结果计算得回归方程：A=0.9311C-0.0016，相关系数r=0.9993，说明芦丁浓度与吸光度之间有良好的线性关系。其中，芦丁的标准工作曲线如下，图2-1 芦丁标准曲线图2.2.2.3 抑菌生物活性测定2.2.2.2.1 LB固体培养基的配制1）配制 取4g固体粉末加入100ml无菌水，用铝箔和玻璃纸密封，置于高压灭菌锅中121灭菌20min左右，冷却备用。2）菌饼制备 将配制好的LB固体培养基在微波炉上加热，直到全部溶解。在超净台中，取1ml提取液加入100ml培养基中快速摇匀，迅速倒入直径为6cm的培养皿中，制成带毒培养基，风干30min-1h。2.2.2.2.2 菌种的培养和菌源的制备1）摇菌在无菌环境下，取大肠杆菌的甘油菌350l，接种至25mlLB培养基中，混匀，密封后置于37摇床中，180rpm振荡培养10-12h，置于4冰箱中备用。2）菌种的扩大培养取上述培养物200微升接种至LB液体培养基中，继续振荡培养8h。2.2.2.2.3 滤纸片法研究抑菌活性首先将提取液进行稀释，稀释方法为取50ul的提取液原液，加入200ul超纯水形成5倍稀释样品，再向5倍稀释样品中加入250ul超纯水，形成10倍稀释样品。在培养皿中倒入LB固体培养基，10ul大肠杆菌的菌液，在培养基上置3个滤纸片，分别浸有黄酮提取液及5倍、10倍稀释样品，（浓度分别为：0.381,0.0762,0.00381），测量抑菌圈半径，平行测定三次。2.2.2.4 金银花中基本成分的定性检测1） 生物碱的定性检测 将提取液取大约1ml放入试管中，然后滴加少许的碘化铋钾试剂，震荡一会后静置，然后观察有无红棕色沉淀出现。若有沉淀出现证明提取液中有生物碱类物质，否则没有。2） 黄酮类物质的定性检测将提取液取大约1ml放入试管中，加入少量镁粉，混匀后滴加少量浓盐酸，震荡后观察提取液颜色的变化，若有颜色变化证明提取液中有黄酮类物质，否则没有。3） 多糖的定性检测 将提取液约1ml放入试管中，再分别滴加四滴新配制的-萘酚溶液，混合均匀，将试管倾斜45沿管壁慢慢加入1ml的浓硫酸，且勿摇动，然后小心的竖起试管，硫酸和提取液明显分两层，静置10-15min，观察两层之间有无紫色环出现，若无紫色环出现，可将试管放入热水浴中温热3-5min再观察现象。若一直无紫色环出现，则证明提取液中没有多糖，若出现紫色环证明提取液中有多糖类物质。4） 蛋白质的定性检测将提取液取大约1ml放入试管中，再加入几滴水合茚三酮试剂，振荡，观察现象。若无蓝紫色化合物生成，则证明提取液中没有蛋白质，若有蓝紫色物质生成则证明提取液中有蛋白质。5）酚类物质的定性检测将提取液取大约1ml放入试管中，再加入几滴新配制三氯化铁溶液，振荡，观察现象。若有颜色变化，则证明提取液中含有酚类物质，否则没有。3 实验结果分析3.1 各种方法总黄酮的测定结果 利用上述对芦丁标准曲线的测定方法，用同样的方法分别对各种不同方法以及不同浓度的提取液进行相同的处理后对其吸光度进行测定，并且通过对比芦丁标准曲线计算得出其黄酮的总含量，得出最优的提取条件及方法。不同方法的提取效率分别列于下表中。其中平均值的计算方法为样品号分别为1、2、3的吸光度的平均值。相对标准偏差（RSD）的计算方法为100% ，其中s=。3.1.1 索氏提取法测定结果乙醇分数样品号吸光度平均值RSD(%)黄酮含量20%10.0830.0811.8%0.55%20.08130.08040%10.0320.0323.1%0.23%20.03330.03160%10.1130.1131.3%0.77%20.11230.11570%10.1740.1771.7%1.20%20.18030.17780%10.0950.0952.6%0.65%20.09830.093图3-1索氏提取法各浓度吸光度柱状分布图3.1.2 超声波提取法测定结果功率超声时间/间隙时间样品号吸光度平均值RSD(%)黄酮含量200w5s/5s10.4230.4261.6%2.87%20.42230.4345s/10s10.4820.4891.5%3.30%20.49730.489300w5s/5s10.5890.5811.3%3.91%20.57430.5795s/10s10.6010.6060.9%4.08%20.61230.605400w5s/5s10.7800.7880.9%5.30%20.79330.7925s/10s10.8720.8710.4%5.86%20.87430.867图3-2超声波提取法各条件吸光度柱状分布图3.1.3 微波提取法测定结果功率时间样品号吸光度平均值RSD(%)黄酮含量600w5min10.8490.8530.7%5.74%20.85130.86010min10.6200.6250.8%4.21%20.63130.625700w5min10.9980.9910.8%6.66%20.99430.98210min10.8930.8890.4%5.98%20.88730.886800w5min10.9920.9464.5%6.36%20.90830.93810min10.9410.9430.6%6.34%20.93830.950图3-3微波提取法各条件吸光度柱状分布图3.1.4 各种方法所得黄酮总含量的计算结果分析本论文采用三种不同的方法对金银花中的黄酮类化合物进行提取，得出最优的实验方法及条件。实验结果表明，用微波法在700w，5min条件下提取金银花黄酮的含量最高，并且在各种不同浓度的乙醇中，以70% 的乙醇提取率为最高。微波法效率最高的原因是微波穿透能力强，能够引起物质的共振，所以有较好的效果。以下是各种不同方法的黄酮产量曲线，其中系列1为索氏提取法，系列2为超声波提取法，系列3为微波提取法。图3-4 三种方法产量分布图3.2 抑菌活性的测定结果分析浓度(mg/ml)抑菌圈半径0.3810.07620.0038119.1mm4.9mm2.8mm29.0mm5.2mm2.9mm38.9mm5.1mm3.0mm平均值9.0mm5.1mm2.9mm本实验用微波提取法提取液对抑菌生物活性进行了筛选，选取大肠杆菌为供试菌种，进行了抑菌生物活性测定。实验结果表明，在浓度为0.381mg/ml时，金银花中黄酮对大肠杆菌具有较强的抑制作用（平均抑菌圈直径为9mm），当浓度降低时,抑菌效果明显减弱。当浓度为0.00381mg/ml时，基本看不到抑菌效果。 4 结论与讨论本论文以乙醇为溶剂采用索氏提取、微波提取、超声波提取三种不同的方法，对金银花中总黄酮化合物进行系统的提取并选用大肠杆菌为供试菌种对其抑菌生物活性进行了初步的研究。对其生物活性的抑菌研究中，实验结果表明，金银花含有杀菌抑菌活性物质。本实验主要在不同的条件下研究金银花的黄酮化合物的最佳提取工艺，实验证明乙醇浓度70%，在700W的功率下用微波提取法提取5min，此条件下提取得到的黄酮化合物含量最高。在其对大肠杆菌的抑制作用中，在浓度为0.381mg/ml时，金银花中黄酮对大肠杆菌具有较强的抑制作用（平均抑菌圈直径为9mm），其稀释5倍后的抑菌效果明显减弱，而在其稀释10倍后基本上看不到抑菌效果。由于时间关系，本实验还有许多不足之处。所采用的溶剂浓度的范围还有待于进一步加宽；实验用索氏提取、超声波法、微波法对金银花进行提取，通过实验得知70%乙醇的微波提取效果较好，但由于溶剂的种类、浓度，实验温度、时间不同等可能对实验效果产生不同的影响。另外，在抑菌活性的研究方面可以采用更多的菌种来验证其抑菌效果，故实验还需要在参考、比较、系统的基础上进一步完善。致谢时光荏苒，岁月如梭，转眼间我的大学生活就要结束了。在此谨向所有关心过我、帮助过我的老师、同学和亲友表示由衷的感谢。首先要感谢的是我的导师于曙光老师，这篇论文是在于老师的悉心指导下完成的。做论文期间导师不仅在学习和工作上给予了热情关怀和谆谆教导，而且在生活上给予我许多关心、支持和帮助。从试验选题、试验设计到论文的完成无不凝聚着导师的心血。老师勤于治学、勇于探索、孜孜不倦的敬业精神时刻在激励着我，并使我终生受益。还要感谢的是在整个大学期间所有教授过我的老师们，您们不仅教给我科学文化知识，还教我领悟到许多人生和做人的道理，相信所有这些都将是我人生中一笔最宝贵的财富，伴随我成功、成才！在此向我的导师、各位领导以及所有的恩师表示我最崇高的敬意和最衷心的感谢！在实验过程中，我得到了512实验室所有同学的诚恳帮助，他们是李琛、李阳、王静、鞠洪斌等，与你们的共同学习和交流为我的论文提供了很多灵感和思路。在此，向你们表示真诚的谢意和永远的祝福！最后，我要将所取得的成绩献给我的父母，这本论文的完成凝聚着父母的关怀和期待。他们给予我的无私的关怀和真挚的爱，无时无刻不在督促着我奋发图强，我相信，优异的成绩是对父母最好的报答！参考文献1 徐炳声. 中药金银花原植物研究J. 药学学报, 1979, 14 (1) : 23.2 朱广军, 张琳, 周凤儿, 等. 中药槐花米、黄答和金银花中黄酮类化合物的提取分离J. 全国精细化工有机中间体学术交流会论文, 2002, 86-90.3 张玲, 彭广芳, 钟方晓, 等. 山东金银花挥发油的化学成分分析J . 时珍国医国药, 1996, 7 (2) : 89-91.4 李会军, 张重义, 李萍. 忍冬不同药用部位挥发油成分分析J . 中药材,