波尔山羊胚胎移植技术对比研究.doc

波尔山羊胚胎移植技术对比研究重庆市渝北区畜牧兽医站 李明摘要：本研究分别采用子宫角移植和输卵管移植两种胚胎移植方法对20只供体母羊和153只受体羊进行胚胎移植。结果发现，虽然输卵管法冲胚平均数达11.6枚，比子宫角法（冲胚平均数为6.59枚）效果好，但是，子宫角法的妊娠率、产羔率和双胎率分别为78%、68%和95%，均显著高于输卵管法。另外，子宫角法的供体母羊生殖系统恢复情况也比输卵管法的好。1 前言胚胎移植作为一项高科技的应用生物技术，自二十世纪三十年代，在家兔上首次获得成功以来，相继在绵羊、山羊、猪、牛、马等家畜上获得成功10。近年来，我国波尔山羊胚胎移植在季节选择、供受体羊选择、同期发情、超数排卵、配种、采胚和移胚、供受体羊饲养管理和胚胎发育阶段对移植成功率的影响等方面的研究较多2，4，11。每头次波尔山羊经过超数排卵、胚胎移植，平均可产6.68（344/50）头羔羊，若1年内1头波尔羊重复2次可获得13.4头羊羔，与常规育种相比极大地提高了纯种波尔山羊的繁殖速度7。我们在这些研究的基础上，结合本地特点，对波尔山羊进行了胚胎移植技术对比研究，现报告如下。2 材料与方法2.1 药品 阴道栓、FSH (澳大利亚进口)、孕马血清、氯前列烯醇(PG)、CO2 气体、胚胎培养液、麻醉剂、苏醒灵等（上海产）。2.2 方法2.2.1 场地准备30-40m2的房间,分隔为1个缓冲间、胚胎回收和移植手术室2间、1个胚胎操作室。室温保持在22-25,并用1:150百毒杀室内消毒.2.2.2 供体选择供体羊(波尔山羊)为经产2-5胎的母羊，身体健康状况良好,生殖器官正常, 正常繁殖史,繁殖力较高,断奶1个月以上，未孕。2.2.2 受体选择受体羊健康状况良好,无生殖器官疾病的适繁母羊。2.3.3 供、受体羊饲养管理对供、受体羊进行常规传染病和寄生虫病的防治。饲养管理遵循一般繁殖羊群的原则。保持羊群体况适度,根据羊群营养状况适时调整日粮标准,即增加蛋白质、能量饲料补充料,并注意矿物质和维生素的供应。2.3.4 供、受体羊的同期发情供体羊与受体羊同时置入炔诺酮阴道栓，每两天置换一次，一般预处理半个月后和供体同时撤除阴道栓,撤栓后36-48小时观察发情。2.3.5 供体羊超数排卵供体羊(波尔山羊)进行超排处理：肌肉注射FSH，每天肌注两次,连续注射4天,第一次肌注2m1,以后每天上、下午各注射1.5ml,最后一天上午注射1.5ml、下午注射0.5 ml，同时每天各注射一次营养液（含各种矿物质、维生素等）2ml/头。注射4天后，撤除阴道栓，38-48小时观察发情。2.3.6 供体羊配种选择优质波尔山羊种公羊与供体波尔母羊自然交配,第1次授精在供体母羊发情后8小时进行，随后每隔8-10小时授精1次,共授精4次。2.3.7 波尔山羊子宫角胚胎移植供体羊的冲胚：在超排处理授精后第5天回收胚胎,对供体羊采取前低后高半仰姿势(前半身侧卧，后半身仰卧式)保定在手术台上，腹下部剪毛、消毒、全身麻醉,颈静脉注入8-10ml抗菌素。在腹底部偏右侧距乳房基部3-4cm处做一长4-5cm的纵向切口，逐层切开,切开腹膜后,将中指和食指伸入腹腔在骨盆腔前沿膀胱之下触摸子宫角,把子宫角牵引到切口之外,再小心把卵巢引出,检查卵巢黄体发育情况。回收时用套有乳胶管的肠钳夹住子宫角后1/3处, 为防冲洗液流入输卵管,再用血管夹夹住宫管接合部之前的输卵管,在宫管接合部后约3cm处插入进液针头,向子宫内缓慢推入冲卵液,在子宫角用手夹住前端插入一个带有胶管的回收圆针,收集冲胚液,冲胚液用量为30-50ml。一侧冲洗结束时,除去器械,检查针孔,确认无出血现象,安全送于腹腔内,然后按上述同一操作办法进行另一侧冲洗。两侧冲洗完毕后, 为防感染和粘连,将子宫送回腹腔后向腹腔内倒入适量生理盐水,最后逐层进行缝合。镜检：用倒置相差体视显微镜检查从子宫回收到的冲胚液,鉴定胚胎发育状况。胚胎保存：用吸卵管吸取发育成熟的胚胎,放入PBSS中保存,在24-26下,保存时间不超过4-5小时。受体羊植胚手术：将受体羊麻醉后采取前高后低半侧卧保定，进行剃毛、消毒,在腹后部、距离两乳头约10处，左右分别打两个孔,左侧放入腹腔镜,右侧注入C02气体,使腹腔膨胀,用腹腔镜检查卵巢黄体发育情况，若有孕妊黄体,且生殖系统无炎症,即作为受体羊,无黄体或黄体过小的受体不能做移植。在两孔中间再打一孔,用长钩钩出子宫角,用早已准备好的装有胚胎(一枚或两枚)的注射器注胚胎于子宫角内。移植结束后,把子宫角送入腹腔,按常规手术要求缝合腹壁创口。2.3.8 波尔山羊输卵管胚胎移植供体羊冲胚：供体羊的冲胚手术在授精后68-72小时进行。首先，对供体羊全身麻醉，剪干净腹下部的毛，消毒后,采取前低后高半仰姿势将其保定在手术台上。在腹底部偏右侧距乳房基部3-4cm处做一长4-5cm的纵向切口，逐层切开,切开腹膜后,将中指和食指伸入腹腔在骨盆腔前沿膀胱之下触摸子宫角,把子宫角牵引到切口之外,再把卵巢引出,检查黄体发育情况,如果黄体发育正常，即冲胚。冲胚时，在输卵管伞部前端插入一个带有胶管的回收圆针，并用手卡住，准备收集冲出的胚胎；再向输卵管的壶腹部处,插入装有冲胚液的进液针头,缓慢推入冲胚液，将胚胎冲入器皿中,冲胚液用量30-50ml。一侧冲洗结束时,除去器械,检查针孔,确认无出血现象,将输卵管送回腹腔内,然后按同一操作办法进行另一侧冲胚。两侧冲洗完毕后,将子宫送回腹腔并向腹腔内注入生理盐水,最后逐层进行缝合。镜检及胚胎保存：同2.3.7。受体羊胚胎移植：首先，对受体羊注射麻醉剂，实行全身麻醉，麻醉后剪干净腹下部的毛，消毒,采取前低后高半仰姿势将受体羊保定在手术台上,在腹底部偏右侧距乳房基部3-4cm处做一个长4-5cm的纵向切口,逐层切开,切开腹膜后,引出子宫、输卵管以及卵巢，检查黄体，无黄体或黄体过小的受体羊不能做胚胎移植；若有孕妊黄体,且生殖系统无炎症,即作为受体羊。将受体羊黄体一侧的输卵管伞部拔开，用装入胚胎的注射器从此处插入3-4，将胚胎注入输卵管内。移植结束后,把子宫角送入腹腔,在创口洒上抗菌素，防止感染，按手术要求缝合好腹壁创口。3 结果与分析3.1 两法供受体羊移植双胚数表1子宫角法和输卵管法胚胎移植双胚率比较表方法供体羊（只）有效胚胎数（枚）受体羊（只）其中双胚（%）供体母羊供体公羊子宫角法2291397395输卵管法1251278058从表1可知，子宫角法和输卵管法胚胎移植双胚率显著不同（P0.05），子宫角移植法双胚的受体羊多，高达95%，说明受体同期发情效果好，功能黄体发育正常，分泌的激素孕酮水平高，有利于胚胎的正常着床。3.2 波尔母羊超排效果的比较表2 子宫角法和输卵管法胚胎移植排卵效果比较方法供体母羊（只）超排最高数（枚/只）超排最低数（枚/只）平均数（枚）总胚胎数（枚）有效胚胎数（枚）子宫角法221446.59145139输卵管法1218011.6140127从表2可见，子宫角冲胚最高14枚，而输卵管冲胚最高18枚，子宫角冲胚平均数为6.59枚，而输卵管冲胚平均数达11.6枚，仅从冲胚效果看，输卵管冲胚比子宫角效果好。虽然输卵管取胚效果好，但胚胎基本上在二分体或四分体时期（见图1），这时，功能黄体还未充分分泌足够的孕酮，四分体时期胚胎也容易被子宫吸收。而子宫角冲胚（配种后7天），胚胎处在囊胚阶段(图2)，是着床的最好时期，而子宫内环境也最适合胚胎着床，孕酮水平最高。 图1 处于二分体到四分体的胚胎 图2 桑椹胚（左）和囊胚（右）3.3 妊娠情况分析表3 子宫角法和输卵管法胚胎移植妊娠情况对比分析方法妊娠数（只）妊娠率（%）产羔数（只）产羔率（%）成活数（只）成活率（%）子宫角法577895688387输卵管法273325202392从表3可知，子宫角移植中，妊娠率达78%，产羔率达68%，输卵管移植中，妊娠率为33%，产羔率为20%，子宫角移植达国际先进水平（65%）。从成活率来看，前者87%，后者92%。这可能由于我们第一次做胚移，经验不足，在妊娠过程中，营养相对过剩，造成胎儿过大，难产，使得产羔率相对较低。3.4 手术后供体母羊生殖系统恢复情况比较表4 供体母羊生殖系统恢复情况比较方法第二次使用的供体母羊（只）生殖系统正常供体母羊（只）输卵管粘连（只）子宫炎症（只）子宫角法121002输卵管法8152两法分别在第二次做胚移时，都利用了上次部分做胚移的供体。子宫角法从上次的22只中选出了12只为第二次胚移供体，输卵管法从上次的12 只中选出了8只为胚移供体。从表4可看出，子宫角法有10只波尔山羊生殖系统完全正常，没有发生输卵管粘连，2只有炎症，而输卵管法在8只供体羊中只有1只属正常，输卵管粘连有5只，炎症有两只。这可能因为，输卵管是生殖系统中比较纤细的一段，在冲胚过程容易导致粘连，相反，子宫角比较粗大，在冲胚过程中，只要做到手术规范，一般不至于发生粘连。4 讨论与结论4.1超排与同期发情 供体羊的超数排卵、受体羊的同期发情是胚胎移植比较重要的环节，超排效果好，直接决定胚胎数量，所以除对供体羊的选择有要求外，在超排处理过程中，用药的种类（如FSH、PMSG）、剂量要掌握非常准确；受体羊的同期发情，在药物的比较中，用阴道栓比打PG针效果好，使用阴道栓，比较容易与供体羊发情同步，且发情整齐，受体羊卵巢黄体多，有利于胚胎着床。这与报道结果1，3，5，6，7相似。4.2 冲胚与镜检 冲胚与镜检是移植的中间环节，在冲胚过程中，要求有相当操作经验的人来完成，动作快，冲胚部位准确、干净；镜检要求具有非常专业人员来完成，对胚胎的各个时期的形态掌握要准确，剔除未受精卵、死胚以及低级胚。4.3 胚胎移植 胚胎移植是完成整个胚移过程的核心。从表3可知，子宫角移植的妊娠率达78%，而输卵管移植的妊娠率仅为33%。这与文献报道结果相似，输卵管移植的妊娠率约为56.25%（18/326和270/4807）、5962(3152) 1 和66.2（4365）8。而子宫角移植的妊娠率分别为61.11(4472)10和6303(7451182)3。输卵管移植易发生粘连（见表4），受胎率不高，所以，子宫角移植明显优于输卵管移植。4.4 影响胚胎移植的因素 成年母羊体内环境与外界多种措施及胚胎质量都可影响胚胎移植效果。受体羊与供体羊发情同步程度、受体羊的黄体功能、品种、年龄、手术损伤及外界多方面因素，都影响成功率。受体山羊的黄体数量直接影响到移植产羔结果，黄体数2的受体山羊移植产羔率显著高于黄体数为1的受体山羊移植产羔率（P0.01），分别为64.83(94145)和49.55(110222)9。胚胎质量和发育期对移植成功率也有直接关系。从冲胚效果看，输卵管冲胚比子宫角效果好（见表2）。虽然输卵管取胚效果好，但胚胎基本上在二分体或四分体时期（见图1），二分割胚移植妊娠率仅为20(15)10。二分体或四分体时期，为发情后68-72小时，功能黄体还未充分分泌足够的孕酮，而且四分体时期胚胎也比较脆弱，容易被子宫吸收，造成妊娠率不高。而子宫角冲胚（配种后7天），胚胎处在囊胚阶段(图2)，是着床的最好时期，而子宫内环境也最适合胚胎着床，孕酮水平最高。囊胚和扩张囊胚在发情后7d的移植产羔率分别为62.22%(84/135)和58.26（67115），显著高于桑椹胚（43.18）9。同是子宫角移植，囊胚比桑椹胚的移植受胎率高，分别为66.2（4365）和52.6（81154）8。胚胎移植在普通温度下进行成功率高，在高温情况下移植成功率低，所以取胚后，应尽快移植，鲜胚一般在体外保存不得超过4-8小时，才能获得较高的胚胎发育率。参考文献1. 杜金魁 陈理盾，春季波尔山羊胚胎移植的效果观察，河南畜牧兽医, 2003，24(9).-7-7, 202. 吴建波等，波尔山羊胚胎移植时受体羊的选择及管理，河南畜牧兽医.2003，24(10).-36-373. 李红等，供体母羊及与配公羊个体对波尔山羊胚胎移植效率的影响，西南农业学报.2003,16(3).-76-784. 陈家振，波尔山羊胚胎移植研究进展，畜禽业.2003(9).-11-135. 傅绍存 逄坤波 陈洪友 谭善杰 隋宏书 李增国波尔山羊胚胎移植试验，山东畜牧兽医.2003(2).-7-76. 武浩 赵晓娥 等，波尔山羊胚胎移植试验，畜牧兽医杂志.2003,22(2).-1-37. 贾敏 吴建军 等波尔山羊批量胚胎移植，畜禽业.2002(10).-Y002-Y0038. 杨亚卫