生物实验培训系列之九胶回收.ppt

胶回收 生物实验培训系列之九 目录 2 目录 3 1 胶回收的概念2 胶回收的原理 1 1胶回收概念 从电泳后的凝胶中回收目的DNA的过程 其目的是将目标DNA重新利用 LaneM 1kbDNAMarkerLane1 胶回收前的2 7kbDNA段Lane2 胶回收后的2 7kbDNA段切割Lane1后 经处理回收DNA 经电泳得到Lane2 4 1 2胶回收原理 利用核酸在裂解液下与硅胶膜吸附柱特异性结合 在洗脱液条件下被洗脱 从而达到核酸纯化回收的目的 电泳后 切下凝胶称重后 加入等体积溶胶液上柱吸附DNA除胶脱盐洗脱 5 目录 6 1 分类2 应用 2 1分类 7 2 1 1硅胶柱法 采用可以高效 专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统 从凝胶中回收DNA片段 同时除去蛋白质 其它有机化合物 无机盐离子等杂质 最简单快速的回收方法 不适合用于大片断的回收 8 2 1 2玻璃奶 纯化填料法 利用特殊玻璃微珠吸附DNA的特性 根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量 使得实验不受限于柱子的载量 也不会造成浪费 适合各种不同大小的片断 特别是大片断的回收 玻璃奶 纯化填料法 9 2 1 3低熔点琼脂糖法 传统手工操作方法之一 低熔点琼脂糖制备凝胶 电泳后切割目的条带 在TE溶液中65 保温融化 用传统的酚氯仿抽提 乙醇沉淀 这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂 由于乙醇沉淀需时较长 现已较少使用 10 2 1 4透析带电洗脱法 切下的条带放在充满TAE的透析带中电泳 让DNA跑出凝胶 跑向溶液中 再通过反向电泳 将附在透析带上的DNA赶回溶液中 取溶液部分 再用TAE洗洗袋子 合并溶液后传统方法酚抽沉淀 再次电泳后的胶通常还要再染色看看残留 由于绑透析带很难操作 只有在回收非常大的片断时才会考虑的 丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一 11 2 1 5DEAE纤维素膜纸片法 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理 电泳后在目的条带前切一刀 将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口 不留气泡 继续电泳 条带上的DNA被膜片截留 取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65 保温洗脱 直到膜上DNA被完全洗脱 将溶液用酚氯仿抽提沉淀 早期实验室最常用方法之一 这个方法不适合做较大的DNA 因为洗脱比较困难 12 2 2应用 13 克隆 测序 文库筛选 限制性酶切 连接 目录 14 1 试剂2 耗材3 设备 3 1试剂 15 3 2耗材 各种规格移液枪 枪头离心管 16 3 3设备 离心机 17 水浴锅 3 3设备 凝胶成像系统 水平电泳仪 18 目录 19 1 实验流程2 注意事项 4 1实验流程 4 1 1柱平衡步骤 20 4 1实验流程 4 1 2切胶 称重 21 4 1实验流程 4 1 3溶胶 注 1 如果凝胶重0 1g 其体积可视为100 L 则加入100 L溶液PN 2 若胶块未完全溶胶 可继续放置几分钟或补加一些溶胶液 直至胶块完全溶解 22 4 1实验流程 4 1 4吸附DNA 注 吸附柱容积为800 L 若样品体积大于800 L可分批加入 23 4 1实验流程 4 1 5洗去杂质 注 1 漂洗液PW使用前先检查是否已加入无水乙醇 2 如果回收的DNA是用于盐敏感的实验 例如平末端连接实验或直接测序 建议PW加入后静置2 5min再离心 24 4 1实验流程 4 1 6去除漂洗液 注 1 尽量除尽漂洗液 以防止残留的漂洗液中的乙醇影响下一步的实验 如酶切 PCR等 25 4 1实验流程 4 1 7收集DNA 26 原理 带电颗粒在电场作用下 向着与其电性相反的电极移动称为电泳 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术 4 1实验流程 4 1 8结果分析 琼脂糖凝胶电泳 27 不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围 4 1实验流程 28 在锥形瓶中加入1mL50 xTAE 49mL蒸馏水 0 4g琼脂糖 混匀 放入微波炉中加热 约煮沸三次 冷却至不烫手 加入2 5 LNuclleicAcidStain核酸染料 轻轻摇匀 避免产生气泡 倒入已垂直插好梳子的铺胶版中 待凝固 琼脂糖凝胶制作 上样 电泳 取1 L上样缓冲液与5 L产物混匀垂直加入上样孔中 电泳条件 140V 20min 4 1实验流程 4 1 8结果分析 琼脂糖凝胶电泳 29 4 2结果分析 琼脂糖凝胶电泳 将电泳结束后的凝胶放在凝胶成像系统中拍照保存 对结果进行分析 看有无目的带看是否存在非特异带看条带亮度 30 4 2注意事项 1 洗脱体积不应小于30 L 体积过少影响回收效率 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响 若后续做测序 需使用ddH2O做洗脱液 并保证其pH值在7 0 8 5范围内 pH值低于7 0会降低洗脱效率 31 4 2注意事项 2 平衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性 消除高温 潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响 使用前请先检查平衡液BL是否出现浑浊 如有浑浊现象 可在37 水浴中加热几分钟 即可恢复澄清 32 4 2注意事项 3 电泳时最好使用新的电泳缓冲液 以免影响电泳和回收效果 4 如下一步实验要求较高 则应尽量使用TAE电泳缓冲液 如果回收率较低 可在胶充分溶解后检测pH值 如pH值大于7 5 可向含有DNA的胶溶液中加10 30 L3M醋酸钠 pH5 2 将pH值调制5 7之间 33 4 2注意事项 切胶是 紫外照射时间应尽量短 以免对DNA造成损伤 7 回收10kb的DNA片段时 应加大溶胶液的体积 延长吸附和洗脱的时间 8 回收率与初始DNA量和洗脱体积有关 初始量越少 洗脱体积越少 回收率越低 34 目录 35 5常见问题解答 36 36 5常见问题解答 37 问题解答 胶回收标准实验流程 试剂耗材与设备 胶回收标准实验流程 实验流程 柱平衡步骤 切胶 胶回收标准实验流程 实验流程 溶胶 吸附 胶回收标准实验流程 实验流程 除杂质 去漂洗液 胶回收标准实验流程 实验流程 收集 收集 胶回收标准实验流程 实验流程 结果分析 在锥形瓶中加入1mL50 xTAE 49mL蒸馏水 0 4g琼脂糖 混匀 放入微波炉中加