辛伐他汀降解实验研究.doc

宜顺论文网 www 13LW com 摘要摘要 目的目的 探寻辛伐他汀在苛刻条件下的稳定性 并验证辛伐他汀的检验方法的可行 性 方法 采用 HPLC 法对苛刻条件处理后辛伐他汀的含量与有关物质进行测定 并与原样进行对比分析 结果 含量项下连续进样 5 针标准峰面积的 RSD 为 0 40 3 0 EP 分离 度有关物质 A 与辛伐他汀分离度为 5 9 4 0 结论 上述 HPLC 法系统适应性良好 辛伐他汀微粉前样品在氧化 酸解 碱解 高温 光照条件下不稳定 在避光 高湿条件下 相对稳定 关键字关键字 辛伐他汀 高效液相色谱 有关物质 降解 宜顺论文网 www 13LW com 目录目录 一一 仪器与试剂仪器与试剂 5 5 二二 方法 方法 5 5 2 12 1 溶液配制溶液配制 5 5 2 22 2 高效液相色谱方法高效液相色谱方法的建立的建立 5 5 2 32 3 湿计含量和干计含量湿计含量和干计含量 6 6 2 42 4 杂质限度杂质限度 6 6 2 52 5 系统适应性系统适应性 7 7 2 62 6 含量和有关物质含量和有关物质 7 7 三三 结果结果 9 9 3 13 1 系统适应性系统适应性 9 9 3 23 2 辛伐他汀降解实验结果辛伐他汀降解实验结果 9 9 四 结论四 结论 11 11 五五 附图 附图 HPLCHPLC 色谱图色谱图 13 13 参考文献参考文献 20 20 宜顺论文网 www 13LW com 前前言言 辛伐他汀 simvastatin 其药理作用是作为竞争性抑制剂抑制肝脏细胞内羟甲戊 二酰辅酶 A 还原酶 HMG CoA reductase 活力 限制 HMG CoA 向甲基二羟戊酸 的转化 从而减少内源总胆固醇的生物合成总量 与相同剂量的洛伐他汀 lovastatin 普伐他汀 pravastatin 和氟伐他汀 fluvastatin 等其他 HMG CoA 还原酶抑制剂相比 辛伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和 低密度脂蛋白胆固醇 LDL cholesterol 辛伐他汀经口服后对肝脏有高度的选 择性 其在肝脏中的浓度明显高于其他非靶性组织 辛伐他汀的大部分经肝组 织吸收 主要作用在肝脏发挥 随后从胆汁中排泄 只有低于5 口服剂量的辛 伐他汀活性结构在外围中发现 而其中95 可与血浆蛋白结合 本课题按辛伐他 汀 HPLC 含量及有关物质降解实验方案 用辛伐他汀含量和有关物质检测方法来 检测降解后的辛伐他汀 微粉前和微粉后 判断此 HPLC 方法是否适用于降解 杂质的检测 是否具有稳定指示性 同时研究辛伐他汀 微粉前和微粉后 在 酸 碱 光照 氧化 高湿 高温等条件下的稳定性 探索辛伐他汀 微粉前 和微粉后 在这些条件下可能的降解趋势 宜顺论文网 www 13LW com 正正文文 一一 仪器与试剂仪器与试剂 名称级别批号 含量 若适用 来源 磷酸分析级 20121212 国药集团化学试剂有限公司 磷酸二氢钾分析级 20121024 国药集团化学试剂有限公司 乙腈色谱级 I669430303MERCK 双氧水分析级 20121120 国药集团化学试剂有限公司 0 1mol LHCL 分级级 20130524 本实验室配制 0 1mol LNaOH 分级级 20130607 本实验室配制 水纯化水每日新鲜本厂制备 洛伐他汀标准品 1101 1 98 9 本厂标定 标准品 1301 99 0 USP 1301 99 2 EP 本厂标定 辛伐他汀 样品 B2121148 微粉前 B2121148 M1 微粉后 本厂生产 METTLER XP205 已校正 电子分析天平 METTLER XP6 已校正 光照仪ATLAS SUNTEST XLS 已校正 高效液相色谱仪Agilent 1260 已校正 pH 计METTLER S20 已校正 色谱柱信息 Supelco C18 4 6 33mm 3 m PN 58977 实验室 ID D0148 二二 方法方法 2 12 1 溶液配制溶液配制 稀释剂 0 01mol L 磷酸二氢钾 用磷酸调 pH 至 4 0 乙腈 40 60 系统适应性溶液 取一定量的辛伐他汀和洛伐他汀对照品 加稀释剂配制成 辛 伐他汀浓度为 1 5mg ml 洛伐他汀浓度为 0 015mg ml 的溶液 标准溶液 精密称取辛伐他汀对照品 75mg 至 50ml 容量瓶 用稀释剂溶解并 稀释至刻度 样品溶液 精密称取辛伐他汀样品 75mg 至 50ml 容量瓶 用稀释剂溶解并稀 释至刻度 2 22 2 高效液相色谱方法的建立高效液相色谱方法的建立 2 2 12 2 1 检测波长的确定检测波长的确定 准确吸取 25ug ml 样品溶液 1ml 置于高效液相色谱进样瓶中 通过二极管 宜顺论文网 www 13LW com 阵 列检测器 DAD 检测 在 190nm 360nm 区间进行 DAD 全波段扫描 通过 DAD 扫描结果显示样品在 238nm 附近具有最大吸收 综合考虑确定 238nm 为 高效液 相色谱仪检测波长 2 2 22 2 2 流动相的选择流动相的选择 通过对流动相的筛选和优化 选择乙腈和稀磷酸作为流动相 1 乙腈和稀磷 酸 稀磷酸 精密量取 1 0ml 磷酸 加水稀释至 1000ml 2 2 32 2 3 色谱柱的选择色谱柱的选择 C18 柱是比较常用的色谱柱 它的优点是固定相稳定 可使用多种溶剂 一 般的 C18 柱 PH 值范围都在 2 8 流动相的 PH 值范围广 另外从经济实用性 及样品的分离效果方面 C18 柱较为可取 因此我们选用了 C18 柱 2 2 42 2 4 色谱系统色谱系统 色谱柱 Supelco 33 mm 4 6mm 3 m C18 稀磷酸 精密量取 1 0ml 磷酸 加水稀释至 1000ml 流动相 A 乙腈 稀磷酸 50 50 流动相 B 精密量取 1 0ml 磷酸 加乙腈稀释至 1000ml 0 1 磷酸 V V 时间 min 流动相 A V V 流动相 B V V 0 1000 4 51000 4 6955 8 02575 11 52575 11 61000 131000 检测波长 238nm 流速 3 0ml min 进样量 5 l 2 32 3 湿计含量和干计含量湿计含量和干计含量 进样系统适应性溶液 记录谱图 洛伐他汀相对保留时间约 0 6 辛伐他汀 相 对保留时间为 1 0 两者之间分离度应不得少于 3 0 标准溶液重复进样 5 次 的相对标准偏差应不得大于 1 0 按下式计算辛伐他汀中 C25H38O5的湿计含量 ruCs P 湿计含量 rs Cu 式中 Cu Cs分别是样品溶液与标准溶液中的配制浓度 mg ml rs是标准溶液所对应的主峰响应值 ru为样品溶液所对应的主峰响应值 宜顺论文网 www 13LW com P 为对照品的含量 干计含量计算公式 湿计含量 干计含量 1 干燥失重 2 42 4 杂质限度杂质限度 进样 5 l 样品溶液 记录色谱图 测量所有峰响应 按以下公式计算杂质含 量 100 ri rs ri rs 分别为样品溶液所获色谱图中单个杂质和所有峰面积之和 归一化计算 洛伐他汀和表洛伐他汀 杂质 E F 注意 如果洛伐他汀和表 洛伐他汀都存在 该方法不能完全分离 这两个杂质峰的 RRT 约为 0 6 可 以合并积分计算 辛伐 羟基 酸 杂质 A 亚甲基辛伐 杂质 G 辛伐 乙基酯 杂质 B 脱水辛伐 杂质 C 辛伐二聚物 杂质 D 其它单个未 知杂质 总杂质 除杂质 E F 杂质限度为 0 03 如果单个杂质的平均计算 值少于该限度 则在报告中标明 0 03 相对保留时间 杂质 A 约 0 45 0 5 洛伐他汀 杂质 E 和表洛伐他汀 杂 质 F 约 0 60 杂质 G 约 0 80 杂质 B 2 2 2 3 杂质 C 约 2 3 2 4 杂 质 D 约 3 4 3 8 2 52 5 系统适应性系统适应性 USP 分离度溶液 称取 1 53mg 洛伐他汀 150 12mg 辛伐他汀至 100ml 容量 瓶中 用稀释剂溶解稀释至刻度 EP 分离度溶液 称取 1 07mg 洛伐他汀 1 16mg 辛伐他汀至 50ml 容量瓶中 用稀释剂溶解稀释至刻度 鉴别溶液 称取 EP 鉴别 0 98mg 加入 1 0ml 稀释剂溶解 标准溶液 精密称取辛伐他汀对照品 75 75mg 至 50ml 容量瓶 用稀释剂溶 解并稀释至刻度 按照 SOP 描述中的方法 当色谱系统平衡后 进样空白 EP 分离度溶液 USP 分离度溶液 5 针标准溶液 记录峰响应值 结果见表 1 2 62 6 含量和有关物质含量和有关物质 2 6 12 6 1 原样测定原样测定 准确称取辛伐他汀样品微粉前 B2121148 75 00mg 74 39mg 微粉后 B2121148 M1 75 12mg 75 01mg 分别置于 50ml 容量瓶中 用稀释剂溶解 定容至刻度 同时评价干燥失重 待系统稳定后 分别进样 1 针 用 DAD 检测器记录图谱并测定主峰纯度 2 6 22 6 2 酸降解测定酸降解测定 准确称取辛伐他汀样品微粉前 B2121148 75 42mg 微粉后 B2121148 M1 75 11mg 分别置于 50ml 容量瓶中 分别加入 1 0ml 稀释剂溶解后 再 宜顺论文网 www 13LW com 分别加入 1 0ml 0 05mol L 盐酸 放置 0 5h 后 分别用 0 05mol L 氢氧化 钠溶液中和 用稀释剂稀释至刻度 待系统稳定后 分别进样 1 针 用 DAD 检测器记录图谱并测定主峰纯度 2 6 32 6 3 碱降解测定碱降解测定 准确称取辛伐他汀样品微粉前 B2121148 75 35mg 微粉后 B2121148 M1 75 03mg 分别置于 50ml 容量瓶中 分别加入 1 0ml 稀释剂溶解后 再 分别加入 1 0ml 0 05mol L 氢氧化钠 放置 0 5h 后 分别用 0 05mol L 氢 氧化钠溶液中和 用稀释剂稀释至刻度 待系统稳定后 分别进样 1 针 用 DAD 检测器记录图谱并测定主峰纯度 2 6 42 6 4 氧化降解测定氧化降解测定 准确称取辛伐他汀样品微粉前 B2121148 75 11mg 微粉后 B2121148 M1 74 59mg 分别置于 50ml 容量瓶中 分别加入 1 0ml 稀释剂溶解后 再 分别加入 1 0ml 30 双氧水 放置 3h 后 用稀释剂稀释至刻度 待系统稳定后 分别进样 1 针 用 DAD 检测器记录图谱并测定主峰纯度 2 6 52 6 5 高温高湿降解测定 高温高湿降解测定 40 75 40 75 称取辛伐他汀样品 微粉前 B2121148 微粉后 B2121148 M1 各约 1200mg 平摊于称量瓶中置于温度为 40 湿度为 75 的恒温恒湿箱中放置 5 天后取 出 备用 准确称取上述高温高湿降解辛伐他汀样品微粉前 B2121148 75 02mg 微粉 后 B2121148 M1 75 15mg 分别置于 50ml 容量瓶中 用稀释剂溶解定容至刻 度 同时评价样品干燥失重 待系统稳定后 分别进样 1 针 用 DAD 检测器记录图谱并测定主峰纯度 2 6 62 6 6 高温降解测定高温降解测定 60 60 称取辛伐他汀样品微粉前 B2121148 约 1200mg 平摊于称量瓶中置于高温 60 的干燥器中室温放置 5 天后取出 备用 称取辛伐他汀样品微粉后 B2121148 M1 约 1200mg 平摊于称量瓶中置于高温 60 的干燥器中室温放置 1 天后取出备用 准确称取上述高温降解辛伐他汀样品微粉前 B2121148 75 29mg 微粉后 B2121148 M1 75 11mg 分别置于 50ml 容量瓶中 用稀释剂溶解定容至刻度 同时评价样品干燥失重 待系统稳定后 分别进样 1 针 用 DAD 检测器记录图谱并测定主峰纯度 2 6 72 6 7 光降解测定光降解测定 称取辛伐他汀样品 微粉前 B2121148 微粉后 B2121148 M1 各约 1200mg 分别平摊于称量瓶中置于光照度为 600w m2 光照箱内 24h 后 置于干燥器中 冷却至室温 备用 准确称取上述光降解辛伐他汀样品微粉前 B2121148 74 69mg 微粉后 B2121148 M1 74 10mg 分别置于 50ml 容量瓶中 用稀释剂溶解定容至刻度 宜顺论文网 www 13LW com 同时评价样品干燥失重 待系统稳定后 分别进样 1 针 用 DAD 检测器记录图谱并测定主峰纯度 2 6 82 6 8 避光样品测定避光样品测定 除将样品外置一黑色 PE 袋 再外加一铝箔袋包装外 其余操作均等同于光 降解实验 准确称取上述避光降解辛伐他汀样品微粉前 B2121148 75 23mg 微粉后 B2121148 M1 75 06mg 分别置于 50ml 容量瓶中 用稀释剂溶解定容至刻度 同时评价样品干燥失重 待系统稳定后 分别进样 1 针 用 DAD 检测器记录图谱并测试主峰纯度 三三 结果结果 3 13 1 系统适应性系统适应性 表 1 系统适应性结果 序号峰面积图谱编号 17480 758320130062505 D 27452 9648420130062506 D 37424 6508820130062507 D 47417 4511720130062508 D 57407 4628920130062509 D 平均值7436 66 RSD0 40 USP 分离度 R 5 720130062503 D EP 分离度 R 5 920130062502 D 接受标准RSD 1 0 R USP 3 0 R EP 4 0 由上表实验结果可知 各项均符合规定 此方法系统适应性良好 3 23 2 辛伐他汀降解实验结果辛伐他汀降解实验结果 将上述降解条件下测得的结果汇总至下表 同时评价干燥失重 名称 干燥失重 含量 主峰纯度因子图谱编号 20130062517 D 原样98 9999 9 20130062518 D 酸解96 7999 920130062521 D 碱解85 3999 920130062522 D 氧化 0 03 97 3999 920130062530 D 高湿0 0499 2999 920130062532 D 高温0 0399 1999 920130062535 D 光照0 0397 7999 920130062538 D 宜顺论文网 www 13LW com 表 2 微粉前 B2121148 各降解条件下的主成分峰纯度结果 原样和各降解条件下的样品的主峰纯度因子均大于 990 说明该方法的专属性 及稳定性指示性良好 表 3 微粉前 B2121148 各降解条件下已知杂质和总杂质结果汇总 名称AE FGBCD总杂质 原样 0 09770 29680 10110 03970 06150 09420 6909 酸解 3 10140 29280 09620 03650 06480 09093 6827 碱解 14 25900 27140 09270 03600 08710 072214 8575 氧化 0 16180 29350 09530 03870 06160 09261 0474 高湿 0 10580 29630 09780 03590 06380 09220 6917 高温 0 06790 26890 08020 03760 06640 06310 6226 光照 0 10850 28990 09190 03910 06300 05411 0134 避光 0 10050 29510 09750 03850 06360 09330 6885 表 4 微粉前 B2121148 各降解条件下未知杂质结果汇总 RTRRT碱解氧化高温光照 0 204 0 204 0 07 0 1327 0 2440 08 0 0811 0 3410 12 0 0599 0 4590 16 0 0879 0 0413 0 5940 21 0 1875 0 6290 22 0 6820 24 0 9810 340 0391 4 3641 51 0 02860 03850 0530 表示 未检出 表 5 微粉后 B2121148 M1 各降解条件下的主成分峰纯度结果 名称 干燥失重 含量 主峰纯度因子图谱编号 原样0 0399 0999 920130062519 D 避光0 0599 2999 920130062540 D 接受标准峰纯度 990 宜顺论文网 www 13LW com 20130062520 D 酸解95 2999 920130062528 D 碱解84 5999 920130062529 D 氧化97 8999 920130062531 D 高湿0 0498 1999 920130062533 D 高温0 0498 0999 920130062546 D 光照0 0496 7999 920130062543 D 避光0 0398 7999 920130062545 D 接受标准峰纯度 990 原样和各降解条件下的样品的主峰纯度因子均大于 990 说明该方法的专属性 及稳定性指示性良好 表 6 微粉后 B2121148 M1 各降解条件下已知杂质和总杂质结果汇总 名称AE FGBCD总杂质 原样 0 06150 29040 08100 03670 05930 07440 6412 酸解 3 26460 31600 09880 03440 05970 07263 8815 碱解 14 15100 28530 08880 03570 08100 056314 7796 氧化 0 15620 32220 10220 04530 07450 07071 0279 高湿 0 13080 32300 09920 03640 05750 06880 7451 高温 0 10070 32840 09860 03290 06370 07390 7375 光照 0 08790 29250 08280 03330 06160 05401 3443 避光 0 07720 29440 08370 03090 06180 06880 6527 表 7 微粉后 B2121148 M1 各降解条件下未知杂质结果汇总 RTRRT原样酸解碱解氧化高温光照避光 0 204 0 204 0 07 0 2203 0 2440 08 0 1391 0 3410 12 0 0982 0 4590 16 0 0753 0 0871 0 5940 21 0 0491 0 6290 22 0 1394 0 6820 24 0 0441 0 9810 34 0 0444 4 3641 510 03820 03550 03720 04210 03930 06470 035 9 宜顺论文网 www 13LW com 表示 未检出 四 结论四 结论 4 14 1 系统适应性及专属性系统适应性及专属性 含量项下连续进样 5 针标准峰面积的 RSD 为 0 40 3 0 EP 分离度有关物质 A 与辛伐他 汀分离度为 5 9 4 0 各项均符合规定 系统适应性良好 通过对主峰纯 度进行分析 原样及各降解条件下样品主峰纯度因子均大于 990 说明该 含量方法的稳定性指示性良好 4 24 2 酸降解实验酸降解实验 在酸降解 0 5h 条件下 辛伐他汀微粉前 B2121148 含量下降 有关物质 A 升高 有关物质 E F G B C D 均无明显变化 无新增杂质 总杂质升高 辛伐他汀微粉后 B2121148 M1 含量下降 有关物质 A 升高 有关物质 E F G B C D 均无明显变化 无新增杂质 总杂质升高 辛伐他汀微粉前和微粉后样品在酸解条件下均不稳定 4 34 3 碱降解实验碱降解实验 在碱降解 0 5h 条件下 辛伐他汀微粉前 B2121148 含量下降 有关物质 A 升高 有关物质 E F G B C D 等均无明显变化 同时新增 1 个未知杂质 总杂质升高 辛伐他汀微粉后 B2121148 M1 含量下降 有关物质 A 明显升高 有关物 质 E F G B C D 等均无明显变化 同时新增 1 个未知杂质 总杂质升高 辛伐他汀微粉前和微粉后样品在碱解条件下均不稳定 4 44 4 氧化降解实验氧化降解实验 在氧化降解 3h 条件下 辛伐他汀微粉前 B2121148 含量下降 有关物质 A 升高 E F G B C D 等均无明显变化 同时新增 3 个未知杂质 总杂质 升高 辛伐他汀微粉后 B2121148 M1 含量下降 有关物质 A 升高 有关物质 E F G B C D 等均无明显变化 同时新增 2 个未知杂质 总杂质升高 辛伐他汀微粉前和微粉后样品在氧化降解条件下不稳定 4 54 5 高温降解 高温降解 60 60 实验 实验 在高温降解 60 5 天条件下 辛伐他汀微粉前 B2121148 含量无明显 变化 有关物质 A E F G B C D 等均无明显变化 同时新增 1 个未知杂质 总杂质无明显变化 在高温 60 1 天条件下 辛伐他汀微粉后 B2121148 M1 含量下降 有关物质 A 上升 有关物质 E F G B C D 等无明显变化 无新增杂质 总 杂质升高 宜顺论文网 www 13LW com 辛伐他汀微粉前和微粉后样品在高温条件下均不稳定 相比较微粉前样品 辛伐他汀微粉后样品在高温条件下稳定性更差 4 64 6 高温高湿 高温高湿 40 75 40 75 降解 降解 在高温高湿 40 75 降解 5 天条件下 辛伐他汀微粉前 B2121148 含量 无明显变化 有关物质 A E F G B C D 均无明显变化 无新增杂质 总杂 质无明显变化 辛伐他汀微粉后 B2121148 M1 含量下降 有关物质 A 升高 有关物质 E F G B C D 等均无明显变化 无新增杂质 总杂质升高 辛伐他汀微粉前样品在高温高湿条件下相对稳定 微粉后样品在高温高湿 条件下是不稳定的 4 74 7 光降解实验光降解实验 在光降解 24h 条件下 辛伐他汀微粉前 B2121148 含量下降 有关物质 A E F G B C D 等均无明显变化 同时新增 5 个未知杂质 总杂质升高 辛伐他汀微粉后 B2121148 M1 含量下降 有关物质 A 升高 有关物质 E F G B C D 等均无明显变化 同时新增 6 个未知杂质 总杂质升高 辛伐他汀微粉前和微粉后样品在光照条件下均不稳定 4 84 8 避光降解实验避光降解实验 在避光降解 24h 条件下 辛伐他汀微粉前 B2121148 含量无明显变化 有 关物质 A E F G B C D 等均无明显变化 无新增杂质 总杂质无明显变化 辛伐他汀微粉后 B2121148 M1 含量无明显变化 有关物质 A E F G B C D 等均无明显变化 无新增杂质 总杂质无明显变化 辛伐他汀微粉前和微粉后样品在避光条件下相对稳定 4 9 从以上降解实验可知 辛伐他汀微粉前样品在氧化 酸解 碱解 高温 光照条件下不稳定 在避光 高湿条件下 相对稳定 其中 辛伐他汀有关 物质 A 在酸解 碱解 氧化条件下不稳定 在高温 高湿 光照 避光条 件下相对稳定 其余各杂质均相对稳定 辛伐他汀微粉后样品在氧化 酸解 碱解 高温 高湿 光照条件下不稳 定 在避光条件下 相对稳定 其中有关物质 A 在酸解 碱解 氧化 高 湿 高温 光照条件下不稳定 在避光条件下相对稳定 其余各杂质均相 对稳定 相比较微粉前样品 微粉后样品在受热后 样品稳定性较差 高湿实验显 示样品无吸湿性 原样及各降解条件下样品主峰纯度因子均大于 990 说 明该方法专属性及稳定性指示性良好 五五 附图附图 HPLCHPLC 色谱图色谱图 各降解条件下典型图谱拷贝如下 宜顺论文网 www 13LW com 图 1 溶剂 图 2 酸碱空白溶液 图 3 氧化空白溶液 宜顺论文网 www 13LW com 图 4 标准溶液 图 5 0 5 对照溶液 图 6 样品溶液 微粉前 B2121148 宜顺论文网 www 13