伞形科植物叶片中蛋白质的分离与纯化及利用.doc

伞形科植物叶片中蛋白质的分离与纯化及利用SDS-PAGE电泳法测定相对分子质量生物工程09（2）班 张翔 指导老师：张芬琴（甘肃省河西学院生命科学与工程系 734000）摘 要：分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力。SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定的比例与蛋白质分子结合成为带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决与分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作的标准曲线来求得未知蛋白质的相对分子质量。关键词：伞形科植物；叶片；蛋白质；分离；电泳法引 言: 20世纪60年代Shapiro建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性，但对于Mr小于10000的蛋白质来说是无能为力的1. 20世纪80年代初Sch%26auml;gger等2应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，但分离效果不甚理想且重复性较差.之后他们又进行了系统地研究和摸索，能够分离较大Mr范围内的蛋白质.随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出.我们在进行基因工程药物的开发研制中，对SDS-PAGE方法进行了多次改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了理想的结果.此法所需仪器简单，操作方便，重现性好，时间短，只需微克量的蛋白质便可显带且能迅速估计出其Mr，值得进一步推广和利用.材料和方法：1.1试剂 Tris-HCl缓冲液(pH8.0)， 30 mM Tris-HCl (pH8.0)9, （含0.1 mM EDTA, 6mM Ascorbic acid，5 mM MgCl2)混匀。用缓冲液溶解离心后的上清液即蛋白质溶液，葡聚糖凝胶G-75 (Sephadex-G75)， 丙烯酰胺储备液， 十二烷基硫酸钠（SDS） ， 分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）， TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)， 过硫酸铵(须新鲜配制)， 电极缓冲液 ， 染色液 ， 脱色液1.2器材层析柱(2.530cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；试管及试管架；量筒10m1；1.5mlEpendorf管；移液器（1000L、 0.5-10L）， 高速冷冻离心机， 电泳仪1.3方法装柱：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。加样品：打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。取样品溶液1-2毫升，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。最后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为34cm。. 洗脱与收集：连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集1毫升即换一支收集管迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约23mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。将处理过的变性蛋白质样品加入梳子空隙中，将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为80V。过四十分钟后，把电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。取出凝胶，进行染色。结果：不同浓度蛋白质的吸光值图 1 2 3 4 Marker 5 6 7 8 9 凝胶电泳图分析与讨论：蛋白质不同吸光值相应的也不同，由图可知凝胶层析中总共分离出6中不同的蛋白质，峰值值越高说明蛋白质浓度越高，25管峰值较高，说明这几种蛋白质浓度高，15管后峰值较小，说明其蛋白质浓度较小。进一步说明在提取蛋白质溶液时15管之前的蛋白质浓度较高，而之后的蛋白质浓度开始变小。通过对电泳图的分析和测量可得出每种蛋白质的相对分子质量。还可得出蛋白质相对分子质量与迁移率成反比，即：相对分子质量越大，迁移率越小。附件： 1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配制丙烯酰胺储备液（配制含30% (w/v) 丙烯酰胺和0.8% (w/v) 甲叉双丙烯酰胺的溶液100ml）在通风柜中操作，取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蜡膜封口，可在4存放数月。2 分离胶和浓缩胶的配制 试剂10ml 12%分离胶10ml 3% 浓缩胶蒸馏水分离胶缓冲液凝胶贮液浓缩胶缓冲液10% SDS10% TEMED10% AP3.35%2.5ml 4.0ml-0.1ml5 ul50 ul6.74 ml-1.0 ml2.5 ml0.1 ml10 ul50 ul3不同蛋白质的吸光值管数 123456789101吸光度0.0360.1650.4070.5160.4450.3910.2700.1890.2710.1564不同蛋白质的相对分子质量条带泳道1泳道2泳道3泳道4泳道5泳道6泳道7泳道8泳道9道10123461.3558.1836.5126.0159.4350.7058.8048.6044.6557.5743.25 54.0351.2441.0251.7840.1655.7733.90 5不同蛋白质的迁移率条带泳道1泳道2泳道3泳道4泳道5泳道6泳道7泳道8泳道9道101234712568810251129371340 19244523471663 6标准蛋白（marker）标号1234567蛋白质质量迁移率7135040356025921611681592184注 由logMr=Kbm得，b=0.0046，k=1.82 (Mr=分子量，m=迁移率) 参考文献：1王林嵩，毛慧玲.生物化学技术，第一版；北京：