蛋白质糖基化对乳中乳清蛋白-乳糖复合物的功能影响.doc

蛋白质糖基化对乳中乳清蛋白乳糖复合物的功能影响摘要：作为一种普遍存在的翻译后修饰糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响，弄清糖基化发生发展的规律是理解蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。乳清是干酪和酪蛋白生产过程中产生的副产品。乳清蛋白主要包括-乳白蛋白、-乳球蛋白，血清白蛋白和免疫球蛋白等。糖基化反应是将碳水化合物以共价键的形式与蛋白质分子上的-和-相连而形成糖基化蛋白质的美拉德反应。 关键词：糖基化、蛋白质的糖基化、抗原性、乳化性1、前言 作为一种普遍存在的翻译后修饰糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响 弄清糖基化发生发展的规律是理解蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提糖基化发生的特点决定了糖基化相关研究是对分析技术的一大挑战作为蛋白质组学研究的重要组成部分目前蛋白质糖基化研究的重点和难点主要集中于糖蛋白% 糖肽的分离富集和糖蛋白的鉴定% 糖基化位点的确定&个方面相关技术已用于蛋白质组学水平的糖基化研究但都还不够成熟 以生物质谱为核心多学科交叉的蛋白质组学技术始终处于不断发展之中 基于糖基化发生规律的富集检测技术的发展移动质子理论的提出及电子捕获裂解技术的应用必将极大地促进包括糖基化在内的翻译后修饰研究 蛋白质糖基化的研究有助于从基因“蛋白组”糖组这样一个宏观的综合的水平观察分析生命现象从而达到对生命现象更本质的认识。2、糖基化定义及过程 2.1糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，发生于内质网。在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。蛋白质经过糖基化作用，形成糖蛋白。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质功能作用。2.2许多糖蛋白同时具有N-连接的糖链和O-连接的糖链。O-连接的糖基化在高尔基体中进行，通常的一个连接上去的糖单元是N-乙酰半乳糖，连接的部位为Ser、Thr和Hyp的羟基，然后逐次将糖基转移到上去形成寡糖链，糖的供体同样为核苷糖，如UDP-半乳糖。糖基化的结果使不同的蛋白质打上不同的标记，改变多肽的构象和增加蛋白质的稳定性。3、 研究蛋白质的糖基化常用方法 3.1 糖基化常用方法 3.2检测技术荧光染色检测方法与凝集素联用的染色检测方法：蛋白质经过聚丙烯酰胺凝胶分离，印迹到聚偏二氟乙烯膜上，然后与结合了碱性磷酸酯酶解DDAO磷酸盐，生成长波的红色荧光的DDAO来检测。此方法检测糖蛋白的灵敏度约为15ng，依赖于蛋白质的性质和糖基化程度。PROQ有三类凝集素试剂盒：伴刀豆凝集素A用于检测末端有a-甘露糖吡喃糖苷残基或a葡萄糖吡喃糖苷残基且不具有三天线或四天线结构的糖蛋白；小麦胚芽凝集素（WGA）用于检测有N乙酰神经氨酸的糖；西非单叶豆凝集素用于检测末端有非还原性的N乙葡糖胺的糖蛋白。还可以用结合了辣根过氧化物酶的伴刀豆凝集素素A或小麦胚芽凝集素等标记糖蛋白，再用显色剂显色。3.3Pro-Q庐 Emerald 300 Glycoprotein Gel and Blot Stain Kit试剂盒方法3.4可用酶解或化学裂解的方法将糖链从糖蛋白中释放出来，经过2氨基苯甲酸等标记，用毛细管电泳或高效液相色谱等分离，再由检测器检测，以及用质谱，核磁共掁等方法来进行检测。4、蛋白质糖基化研究的内容技术和策略 全面的蛋白质糖基化分析应包括以下几个方面： 蛋白质是否发生了糖基化 是O糖基化,N糖基化还是其他形式的糖基化 糖基化位点在哪个氨基酸残基上 糖基化位点连接的是经过较少加工高甘露糖型的糖链还是经过充分加工复杂型的糖链 某一特定位点连接了几种不同的糖链；此外要阐明糖链的一级结构还应包含以下几个方面的内容：糖链的单糖组成糖苷键在糖环上的连接位置单糖的差向异构（或），绝对构型（D或L） ，以及环型呋喃糖或吡喃糖 ，单糖的连接顺序糖链上非糖取代基磷酸基或磺酸基等的连接位置 。上述目标使分析工作面临巨大的挑战 ，目前还没有任何一种分析技术能解决以上所有问题在糖链结构解析方面应用最广泛的是质谱技术和核磁共振技术，2种技术各有利弊在应用中经常可以互补 。质谱技术的最大优势是其很高的灵敏度可以精确地测定质量在某些情况下还可以得到糖链序列方面的信息，但是质谱技术不能区分参与糖链构造的各种单糖的同分异构体也不能提供连接位置差向异构等结构方面的信息。核磁共振技术是惟一能够提供糖链结构方面所有信息的技术但灵敏度低对样品纯度要求高目前在天然样品的分析中无法得到广泛应用 。近年来侧重糖蛋白中糖链部分的分析方法有一些相关报道但一直没有突破性的进展当前还不具备规模化直接分析糖链组成结构的技术条件，这也是长期以来糖类研究滞后于核酸蛋白研究的一个主要原因。虽然还存在许多问题和不足 ，蛋白质组学已经形成了包括电泳色谱生物质谱及生物信息学工具在内的自成体系的一套技术平台，以生物质谱为核心的这套体系在糖结构分析方面尽管有其局限性， 但在蛋白质多肽分析中已经取得了巨大的成功，鉴于此当前国际上的主要研究策略是利用现有技术体系以糖蛋白 、糖肽中的蛋白 肽部分为重点研究对象 ，分离富集糖蛋白糖肽消除糖基化不均一性及其对质谱分析的影响质量，标记糖基化位点从而扬长避短利用现有技术体系实现大规模高通量糖蛋白及糖基化位点的鉴定。 5、 糖蛋白组学技术现状及发展趋势 5.1分离富集技术 5.1.1凝集素亲合技术 凝集素是一类对不同种类糖有特异性亲和力的蛋白质长期以来被用于糖类的相关研究 ,多种不同来具有不同糖亲和性的凝集素已经被分离出来许多凝集素已经成为商业化产品,日本学者最近提出一种被称为glycocatch 的凝集素亲合技术用于糖蛋白、糖肽的分离富集;该方法已被成功地用于商品化糖蛋白牛胎球蛋白鸡卵清蛋白转铁蛋白以及简单生物线虫和鼠肝人血清等复杂样品。glycocatch大致包括以下几个步骤 糖蛋白通过凝集素亲合色谱得到富集色谱得到富集;所得糖蛋白利用对赖氨酸具很强专一性的蛋白酶Lvs-C进行酶解;酶解产物再次通过第一步的亲合色谱富集得到糖肤;得到的糖肤经过反相高效液相色谱分离;对每一馏分里的糖肤测序;根据序列信息进行数据库检索从而鉴定糖蛋白、确定糖基化位点。不同的凝集素有着针对不同糖基的特异的亲合性，如伴刀豆凝集素(Con A)对甘露糖( Man)有特异的亲合作用、麦胚凝集素(W GA)对乙酞葡糖胺(G1cNAc)有特异的亲合作用等，样品可依次通过不同凝集素进行分类富集。关于“glyco-catch”法己有相关综述详细介绍。诸如此类大规模分离富集鉴定糖蛋白的研究被称为“糖蛋白组学glyco-catch”凝集素亲合技术是目前糖蛋白组学中应用最广的分离富集技术，该技术迄今最成功的应用是Kaji等利用伴刀豆凝集素亲合富集线虫中的糖蛋白，利用PNGase F酶介导的稳定同位素标记N-糖基化位点，鉴定了250个N-糖蛋白，其中83个是膜蛋白，同时确定了400个N-糖基化位点。 5.2糖蛋白鉴定、糖基化位点确定方法 目前基于质谱分析的糖蛋白鉴定一般先对糖基化位点进行特异的质量标记，使之与理论质量有一个差异，然后通过质谱分析检测到这种差异，鉴定糖蛋白，进而通过MSMS检测是在哪个氨基酸残基上发生了这种变化从而确定糖基化位点，也可以通过检测在质谱的气相离子反应过程中由糖链引起的特定质量变化(比如中性丢失、特定的子离子的存在)来鉴定样品是否发生了糖基化。 5.2.1 PNGase F酶法 PNGase F酶法这是目前糖蛋白组学研究中应用最为广泛的一种N-糖蛋白鉴定方法N-糖蛋白鉴定方法。N糖苷酶 ( peptide:N-gly-cosidase F,PNGase F)几乎可以作用于所有的N-糖链，同时使天冬酞胺转变为天冬氨酸，造成相对分子质量增加0.98，从而起到质量标记N-糖基化位点的作用,PNGase F去糖基化反应的条件和胰蛋白酶几乎一致，而且可耐受一定浓度的变性剂i55 i，可以在溶液条件下或胶内进行顺序酶解，应用十分方便、这种方法的最大不足在于不能区分自发脱氨基和酶促去糖基化，这2种反应的结果是一样的，都造成N向D的转化，而自发脱氨现象在样品处理中是常见的iH.y其次，0.98的质量差异以某些质谱仪难以区分，另外PNGase F对于N-糖链五糖核心中与天冬酞胺相连的G1cNA上以-1-3形式连有岩藻糖(fucose)的糖链不起作用。5.2.2 一消除一米氏加成反应一消除一米氏加成反应对于0-糖蛋白来说，现在还没有一种能与N-糖蛋白研究中应用的PNGase F相比的酶用以实现去糖基化、质量标记糖基化位点，所以0-糖基化位点的标记多采用化学法，其中报道较多的是日一消除反应法,该方法基于在碱性环境中Ser、Thr上的0一糖基团会发生日一消除形成I个不饱和的双键，这个双键可以被亲核试剂攻击发生加成反应，使Ser或Thr残基的质量相对其理论质量发生一个特定的变化，也就是使0一糖基化位点被质量标记，而且这种质量标记在PSD或CID的条件下是稳定的，从而可以通过串联质谱测序的方法得到糖基化位点的信息。一消除一米氏加成反应很早就被广泛应用于糖蛋白的相关研究，反应条件也不断改进，比如极性非质子溶剂二甲基亚矾(DMSO)的加入起到了加快反应速度、减少蛋白质的降解以及增强某些难溶亲核试剂的溶解性的作用，加成反应中用的亲核试剂因实验目的的不同而多种多样，如、等也有消除反应完后不进行加成反应直接分析Ser,Thr的消除反应产物2-氨基丙烯酸、2-氨基一2- J烯酸的。近几年来日一消除米氏加成反应与生物质谱技术结合用于0-糖基化位点测定方面己有不少报道，大都是针对1个或几个糖蛋白或糖肤进行的方法学方肉的研究、除了用于O糖基化研究外，一消除米氏加成反应还更为泛地用于蛋白质磷酸化富集、位点鉴定研究，相关报道远比O糖基化研究要多，其中许多方法很值得在0一糖基化研究中借鉴。该方法的不足在于非糖基化或磷酸化的Ser、THr残基的侧链轻基也可能发生一消除，尤其是在较高的温度( 25)和较高的碱浓度下，这是该类方法在应用中应该注意的问题. 5.3蛋白质糖基化对乳中乳清蛋白乳糖复合物发展趋势 目前国内外降低牛乳过敏原性的研究方法尤其是在低致敏性婴幼儿配方奶粉的研究和生产过程中主要有高温法、高压法、 酶解法等。 这些方法工艺条件要求高且在实际生产过程中还存在产品品质及营养物质保存性较差等缺点，利用化学修饰蛋白质例如糖基化、磷 酸化、修饰、 等也已被广泛应用。乳清是干酪和酪蛋白生产过程中产生的副产品。 乳清蛋白主要包括-乳白蛋白、-乳球蛋白，血清白蛋白和免疫球蛋白等1。 近年来，乳清蛋白的生物学活性和功能特性受到大家的广泛关注， 人们正在努力提高乳清蛋白的利用率， 每年约一半的乳清蛋白以废水的形式排放， 不但造成资源的极大浪费而且对环境也造成严重污染。 研究人员注重改善乳清蛋白的功能特性， 以扩大其在食品及其他领域的应用。糖基化反应（glycosylation）是将碳水化合物以共价键的形式与蛋白质分子上的-和-相连而形成糖基化蛋白质的美拉德反应。 本文研究了WPI和乳糖在低温（70 ）短时间条件下的糖基化反应对乳清蛋白乳化特性的影响， 通过研究乳清蛋白-乳糖共价复合物的制备及乳化特性为乳清蛋白的进一步利用探讨新的途径。6、 糖基化蛋白的分离与纯化 糖基化蛋白的分离纯化获得糖基化蛋白的方法主要是电泳法和层析法 。电泳法即通过电泳的方法先得到糖蛋白条带或蛋白点 ,再通过电洗脱或透析的方法得到糖蛋白 。此方法较为费时 , 且在操作中易使蛋白变性 。而层析法则具有快速 、 准确 、 分辨率高 、 稳定性好等特点 ,是分析糖蛋白的理想手段 。 目前 ,利用抗体 、 凝集素进行亲和层析已成为分离纯化糖蛋白的最主要的方法 。 除此之外 ,已有人开始利用多维高效液相色谱对蛋白质进行液相图谱分析 , 并全新研制并测试了一种新的蛋白质组二维分离和差异表达鉴定方法 ,称为22DProteoSep TM。这种方法可以基于蛋白质的等电点 ( p I) 和疏水性 ，获得完整蛋白质组的22DE 图谱 。其中 , 第一维是高效聚焦色谱 ( H PCF) ,分离得到不同 p I 值的蛋白质组分 , 再将每个 p I组分进行第二维的高分辨反相高效液相色谱 ( R P 2H PL C) 分离 。 这种方法有望用于糖蛋白和非糖蛋白的分离纯化 。 层析与凝胶电泳联用也可用来分析蛋白 质 翻 译 后 修 饰 。Claverold 等利用SDS2PAGE 和微小亲水柱层析从同工型 K2 酪蛋白激酶的混合物中鉴定出两种主要的类型及各自的糖基化位点。Larsen 等不仅将液相色谱技术与凝胶电泳技术联用分析糖蛋白 , 还在一步酶解法的基础上建立了两步酶解法 ( 特异性和非特异性酶解) , 并且建立了连续微柱层析 ( 先用 Po ro s R2 柱分离非糖基化的小肽段 , 再用 Graphite powder 柱分离糖基化肽段) 的分离方法 ,从而在卵囊粘蛋白中成功分离出糖肽段 。7、糖基化蛋白质的功能研究有关生物体内源性糖蛋白功能的研究很多 。如 : P HA 是大豆中的一种液泡贮藏糖蛋白 , 它可以被作为一种报告糖蛋白用于研究植物中 N2 糖基化蛋白质的定位。利用重组技术在转基因植物中表达 P HA 结合可分析低丰度的 N2 糖苷结构的高灵敏度的 H PA EC 2PAD 检测方法 ,可以对大豆贮藏蛋白 N2 糖基化的器官特异性进行检测 。RossatoL等在云苔属植物种子中发现了一种糖基化的主根植物性贮藏蛋白 ( V SP)。它可以在植物的开花期大量积累 ,具有特异的流动性 。 研究表明 ,它可以作为一种氮元素缓冲剂在种子的灌浆期大量释放。 8、糖基化反应对乳清蛋白-乳糖复合物乳化性的影响 热处理是乳和乳制品加工过程中最重要的处理这可能引起蛋白质结构的变化(蛋白质的改性/改造)，但主要取决于热处理的时间和程度，热处理时间的延长会引起一系列竞争和级联反应，包括从L-氨基酸到L7 -氨基酸的消旋I;I和赖丙氨酸，糠醛，经甲基糠醛和其他许多未知化合物的形成Izl中等程度的热处理(如63,20 s)就能够引起乳清蛋白组分的变化，可能是由于3-LC通过与乳糖的共价结合而改变了其结构。糖基化改性的目的是在蛋白分子结构改变较小的情况卜，尽量增加蛋白质中亲水性基团的数量，从而使蛋白质达到更好的亲水亲油性的平衡Izil所以，选择的糖基化反应条件，既要保证Aniadori重排产物的生成，同时要避免生成类黑素等高级反应产物Izzl乳清蛋白的热力学行为主要受刀-LC影响，在70时，少于3%的乳清蛋白发生不可逆的展开;130时，如果有还原糖(乳糖)存在，将会发生较人的构型变化-LC在美拉德反应的初期(温度70 )通过与1个或一个乳糖分子相连接而表现出了特殊的改性。Turner等研究表明3-LC与多糖，单糖和双糖在低温(50)、干态(3%水分)条件反应10d可形成共扼物。9、糖基化对乳清蛋白麦芽糖复合物抗原性的影响 糖基化反应条件对乳清蛋白麦芽糖复合物抗原性的影响乳清蛋白中的-乳白蛋白和-乳球蛋白是引起牛乳过敏的主要过敏原1，通过改性降低乳清蛋白过敏原的主要方法有热处理、高压、酶解、糖基化、发酵等。 目前有一些关于糖基化反应降低乳清蛋白抗原性的报道, Enomoto等将麦芽五糖结合到-LA上，降低了-LA的抗原性。 Corzo-Martinez将半乳糖和塔格糖引入到-LG， 有效的降低了-LG的抗原性。另外有研究表明通过糖基化反应将低聚果糖和三甲基壳聚糖分别结合到大豆蛋白和卵清蛋白上，能有效的降低其抗原性。目前还没有关于将麦芽糖通过糖基化反应引入到乳清蛋白对-LA和-LG抗原性影响的研究， 通过糖基化反应将麦芽糖引入到乳清蛋白制备乳清蛋白-麦芽糖， 探索反应时间和蛋白与糖的质量比对乳清蛋白-麦芽糖中-LA和-LG抗原性的影响。10、参考文献1 郭本恒.乳品化学M.北京：化学工业出版社，2001:158-183.2 罗永康,张爱荣. 糖基化反应改善蛋白质功能特性的研究进展J. 食品