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重组抗菌肽的特性：溶解性，抗菌性，影响抗菌肽活性的因素摘要： 菌丝霉素是第一个被发现的真菌防御素，具有强的抗革兰氏阳性菌活性。为了评估菌丝霉素所潜在的治疗应用价值，本文通过生产菌丝霉素，并对其溶解性，抗菌活性及影响抗菌活性的因素进行研究。我们通过融合蛋白表达和柱上酶切，在大肠杆菌中得到高产量重组的菌丝霉素。在10%甘油的醋酸缓冲液中，加入0.5M精氨酸能显著增加菌丝霉素的溶解性，使菌丝霉素的溶解度从89ug/ml上升到408ug/ml。菌丝霉素在Tris-甘油-EDTA缓冲液的溶解度为846ug/ml。菌丝霉素具有抗革兰氏阳性菌肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌活性，其最小抑菌浓度分别为2ug/ml和0.5ug/ml。对革兰氏阴性菌和真菌没有抗菌活性或很低的抗菌活性。菌丝霉素（128ug/ml）对兔子红细胞没有表现出溶血活性。减少二硫酥糖醇的浓度，菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抗菌活性会降低，表明二硫键对于抗菌肽最大活性是必须的。菌丝霉素通过生理作用和二价阳离子作用起到杀菌作用。抗菌活性会有微弱的减低在一定浓度依赖的二价阳离子下，然而，Ca离子浓度超过25mM，抑菌活性完全丧失。这些结果表明，二硫键的存在和二价阳离子的缺乏在菌丝霉素抗菌活性上扮演这一个很重要的角色。关键词：重组 菌丝霉素 溶解度 抗菌活性 二硫键 阳离子1 介绍菌丝霉素，是从腐生真菌上首先分离到的类似防御素的多肽。包括一个-主体结构，由一个螺旋和两个反向股组成，通过3对二硫键来稳定结构(Cys4Cys30, Cys15Cys37 ，Cys19Cys39) 。它对肺炎链球菌有强烈的机制作用，包括那些对传统抗生素有耐药性的菌株，而且在生理离子浓度下也具有杀菌作用。对由肺炎链球菌引起的胸膜炎和肺炎的实验小鼠用菌丝霉素进行治疗，其效果与万古霉素和青霉素相当。菌丝霉素对A549细胞，正常人类支气管上皮细胞，肺成纤维细胞没有毒性，不引起转录，能刺激A549细胞产生IL-8因子，所以其被认为是相对安全的。这些结果表明，真菌菌丝霉素作为临床上潜在的抗生素替代品将会做进一步的研究和关注。菌丝霉素在中性PH条件下溶解性很差，有报道表明，像葡萄糖，精氨酸，EDTA,二甲基亚砜等小分子能有效的抑制其聚集，从而便于蛋白质的正确折叠。我们猜测这些小分子可能是影响菌丝霉素的溶解度。防御素中二硫键被保留下来，一般认为对这一类型的多肽，二硫键在维持结果稳定和生物功能上起着重要的作用。然而，在菌丝霉素中二硫键的作用并没有完全弄明白。体外实验表明，多数防御素的抗菌能力收到阳离子的影响，特别在生理盐水存在的条件下进行评估。菌丝霉素在生理离子强度下表现出杀菌效果。但是阳离子对菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的杀菌活性的确切的影响没有见到相关报道。我们通过大肠杆菌表达系统得到了重组的菌丝霉素，同时研究了小分子对抗菌肽溶解性的影响。我们对重组菌丝霉素的抗菌谱和溶血活性都做了描述，并对二硫桥和离子对抗菌肽的抗菌活性影响做了研究。2 材料与方法2.1菌株和质粒E. coli DH5用来繁殖pET-32a(+)和pETplectasin 质粒, E. coli BL21(DE3)作为表达载体，抗菌活性检测的目标菌株是E. coli CVCC 195(K88), Pseudomonas aeruginosa CVCC 2087,S. aureus ATCC 25923 and S. pneumoniae CVCC 2350 均购于中国兽医药品监察所，2.2 重组表达和菌丝霉素纯化 成熟的菌丝霉素基因是根据大肠杆菌优势密码子通过反转录合成。由sangon生物科技公司（中国上海）合成的包含一个BamHI识别位点，一个蛋白酶因子Xa切割位点，成熟的菌丝霉素编码基因，终止密码子，Xhol位点的DNA序列。经过BamHI，Xhol消化后，将DNA序列连接到pET-32a(+)上，构建重组的PET菌丝霉素质粒载体，将PET菌丝霉素质粒转化到大肠杆菌DH5内，然后在添加100ug/ml的氨苄青霉素LB琼脂平板上培养，通过DNA序列来鉴定质粒的正确链接和转化。在37下，将重组E.coli BL21（DE3）培养在含有100ug/ml的TB培养基里，至OD600为1.0。然后通过添加0.4mM IPTG诱导菌丝霉素基因表达。在30下，诱导表达的时间分别为0h，1h，2h，4h，6h，16h。通过梯度离心（12,000 rpm, 5 min and 4 C），收集上清液，通过12%SDS-PAGE进行分析。1个湿重细胞经过5ml结合缓冲液（50mM NaH2PO4，300mM NaCl,10mM 咪唑，pH8.0）进行悬挂和细胞膜片段化处理（150W，65min of a 30% 工作周期）。细胞碎片通过梯度离心（12000rpm，20min，4）进行去除，上清液通过过His标签的Ni柱层析，用4柱体积的结合缓冲液进行平衡。用结合缓冲液洗便于后续基线吸收，融合蛋白的洗脱过程中4柱体积洗脱缓冲液的速率为1ml/min，分别用四种浓度20，50，80，200，300，500mM咪唑进行洗脱。洗脱的产物用12%的SDS-PAGE进行检测。使用一种数量软件对蛋白质条带进行数量分析。2.3 硫氧还-菌丝霉素融合蛋白柱上切割和菌丝霉素的纯化重组细胞裂解后获得上层碎片被装载到已经平衡了的NiNTA树脂，用4柱体积的含有20mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱。然后用Xa因子的缓冲液进行平衡，切割反应是在包含有20U Xa因子/ml柱体积的切割缓冲液中进行，温度为21，时间分别为0，6，12，24，48，96h。目的肽和His标签融合蛋白相继用4柱体积的和包含有200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱即可。通过0，6，12，24，48，96h切割分离得到相应的产物，并通过麦黄酮SDS-PAGE进行了检测。目的肽在中国科学院生物物理研究所蛋白质组学实验室通过飞行时间解吸质谱检测。2.4 小分子对菌丝霉素溶解度的影响将菌丝霉素装入1000Da截留分子量的透析管中置于去离子水中透析，然后冻干，储存在-20用于活性测定。有四种小分子物质(10% glycerol, 0.5M L-Arg, 20% DMSO and 10mM DTT)被观察到其对菌丝霉素在两种溶液中溶解度有影响.除盐的菌丝霉素溶解在1mg/ml的0.01%HAc缓冲液中和TGE缓冲液（50mM Tris, 0.5mM EDTA, 50mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.9），同时含有1-3的四种测试物质。然后，在室温下，摇床孵化24h。梯度离心收集上清液（15000g, 10min），然后用不含-巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE。使用一种数量软件对蛋白质条带进行数量分析（Version 4.6.2, Bio-Rad, USA）。2.5 抗菌活性和溶血活性的检测 柱切割后获得目的肽片段,过superdex柱进一步纯化，用0.015M NH4HCO3（pH 4.7）流速为0.5ml/min进行洗脱。活性片段进行冻干。用肉汤培养基对最小抑菌浓度进行检测。被测试微生物是处于对数生长期的培养在肉汤培养基中革兰氏阳性细菌，LB培养基中的革兰氏阴性细菌，和TPD中酵母菌。均稀释到1105CFU/ml，使用相同的培养基。MH肉汤培养基中增添5%去纤维蛋白的羊血用于肺炎链球菌的培养。每小分100ul细胞溶液（1-5105CFU/ml）和两倍的肽稀释液进行温育孵化，在35下，大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌孵化16-20h，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌孵化24h，在28下，白色念珠菌孵化24h。对微生物100%抑制的所需要抗菌肽浓度被认定为最小抑菌浓度。每个实验重复三次。菌丝霉素溶血活性是通过以前所发表的方法来测定。每份中分别0.625，1.25，2.5，5，10，20，40，80，160，320，640，1280ug/ml 的菌丝霉素10ul和90ul的2.5%家兔红细胞无菌磷酸缓冲液。37下孵化30min，样品于10000g离心3min，取上清液，置于540nm下测吸光度。溶血程度归因于1% Triton X-100 ，磷酸缓冲液被用来做对照。2.6 菌丝霉素的氧化还原性检测在10mM DTT溶液中，37下温育14和20h，纯的菌丝霉素会被还原。在20% DMSO溶液中，室温放置24h，菌丝霉素会被氧化。菌丝霉素还原和氧化均是通过不含有-巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE和抑制作用区域法进行检测。2.7 一价和二价阳离子对菌丝霉素抗-金黄色葡萄球菌活性的影响要确定阳离子对菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抗性的影响，将以下样品，16ug/ml 的菌丝霉素，1105CFU/ml金黄色葡萄球菌，4种梯度阳离子溶液（0300mM NaCl or KCl and 050mM CaCl2 or MgCl2)加入含有1mM磷酸缓冲液（pH7.4）的100ul体积，37孵化3h，然后，在37下至肉汤培养基培养24h。细菌被杀死的比例通过595nm下测定吸光度值来确定。Fig.1 最佳密码子核苷酸序列和相应的重组菌丝霉素氨基酸序列。氨基酸序列用单个大写字母表示，其写在对应密码子的第二个核苷酸下面。XhoI和BamHI的限制位点和Xa因子的切割位点用箭头标示。画线部分为成熟菌丝霉素的氨基酸序列。星号标识的是终止密码子。3 结果3.1 硫氧还菌丝霉素融合蛋白的表达和纯化硫氧还菌丝霉素融合蛋白条带出现在23kDa附近，而理论相对分子质量为22566.4Da（Fig.2A）。经过4h诱导期后，融合蛋白最大产量达到了总蛋白的53.5%（Fig.2A），58.5%是以融合蛋白的形式存在（Fig.2B）。通过过His标签Ni2+-NTA柱从细菌细胞裂解液中分离纯化融合蛋白部分，洗脱液用80mM咪唑，每升含硫氧还菌丝霉素融合蛋白培养液得到纯度为94.9%的产量达到95.1mg。 Fig2. 重组的硫氧还菌丝霉素融合蛋白在大肠杆菌中的表达。（A）在大肠菌BL21（DE3）中表达的融合蛋白跑的SDS-PAGE。Lane1：大肠杆菌BL21（DE3）的总蛋白； Lanes 2 and 3：含有PET-32a（+）的大肠杆菌BL21（DE3）经过IPTG诱导0h和4h的总蛋白；Lane4-9：经IPTG诱导0，1，2，4，6，16h表达后从大肠杆菌BL21（DE3）中提取的总蛋白量。（B）硫氧还菌丝霉素融合蛋白的不可溶部分，可容部分，和总细胞裂解液的SDS-PAGE （C）SDS-PAGE纯化硫氧还菌丝霉素融合蛋白。Lane1 和2：可溶和不可溶蛋白片段；Lane3：可渗透的顶端 Lanes4-9：从组氨酸标签Ni柱上洗脱纯化硫氧还菌丝霉素融合蛋白 ，缓冲液中咪唑浓度分别为20，50，80，200，300，500mM。Lane M：标准蛋白相对分子质量 3.2 硫氧还菌丝霉素融合蛋白的Xa因子柱上切割Xa因子能切割四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg，被用来除去纯化的硫氧还菌丝霉素融合蛋白中的硫氧还蛋白标签。为增加切割效率和重组多肽产量，柱上切割被作为制备菌丝霉素。经过第一次12h切割后，硫氧还菌丝霉素融合蛋白的量由90.5%降至74%，然后，经过96h切割后，降至51%，带有硫氧还蛋白的量和切割的菌丝霉素增加量相一致（Fig.3A）。经过12h柱上Xa因子切割后，在麦黄酮SDS-PAGE目标分子量处观察到目的条带（Fig.B），用飞行时间基质解吸质谱仪分析得到一个主要的峰，显示目的多肽片段的相对分子质量为4399.12-4407.12（Fig.3C）。这些结果表明重组菌丝霉素是一种混合存在形式，有三对二硫键的氧化态形式（相对分子质量为4401.9Da），有一个或两个二硫键的中间态，和完全不含二硫键的状态（相对分子质量为4407.9Da）.从1L培养物中获取了重组菌丝霉素约1.75mg。3.3 小分子物质对菌丝霉素溶解度的影响菌丝霉素在0.01%的HAc缓冲液中的溶解度很低，仅为89ug/ml(Fig.4.Lane 1). 加10%的葡萄糖后，溶解度没有提高（Fig.4，Lane2）。向含有10%葡萄糖的HAc缓冲液中加入0.5M精氨酸，菌丝霉素的溶解度由89ug/ml增加到408ug/ml，导致其溶解度上升的原因是菌丝霉素由非折叠状态和中间态转变为天然状态。DMSO的添加对菌丝霉素溶解度没有影响（Fig.4，Lane3）.溶解度最高的是加入TGE缓冲液，其溶解度可达到846ug/ml（Fig.4，Lane 6），其是9.5倍于HAc缓冲液中的溶解度。在TGE缓冲液中，甘油具有稳定菌丝霉素，防治菌丝霉素聚集，EDTA能防治Cys被氧化，正于文献所述。然而，在TGE缓冲液中加入Arg或者Arg+DMSO溶液时，菌丝霉素的溶解度降为52%-53%（Fig.4，Lanes7 and 8）。当DTT中加入HAc和TGE缓冲液后，因为溶解度降低，而菌丝霉素电泳条带消失。3.4 抗菌性和溶血活性检测重组菌丝霉素对革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，真菌的抗菌活性均被确定。如表一所示，菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度是青霉素和万古霉素的两倍，对肺炎链球菌的最小抑菌浓度与万古霉素相当，八倍的低于青霉素。很明显，菌丝霉素对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。菌丝霉素同时还对大肠杆菌E. coli CVCC 195(K88)和铜绿假单胞菌CVCC 2087有抗性，浓度达到128ug/ml。但是，白色念珠菌对重组菌丝霉素具有具有耐药性。菌丝霉素浓度达到128ug/ml时都不会引起兔红细胞溶血，而这个浓度会杀死革兰氏阴性细菌。这一结果表明，菌丝霉素没有破坏真核生物细胞膜的完整性。3.5 氧化还原反应对菌丝霉素抗金黄色葡萄球菌活性的影响通过被DMSO氧化或者DTT还原的溶解状态的菌丝霉素的研究，来决定菌丝霉素二硫键的功能。氧化态的抑菌圈直径（d Fig.5A）和还原态的抑菌圈直径（f Fig.5A）分别为23和9.5mm。这些结果表明，对菌丝霉素表现出最大抗菌活性而言，折叠三级结构中二硫键是必须的。凝胶分析表明，菌丝霉素经DTT处理1h后的还原态形式比氧化态形式走的更快。（Fig.5B,Lanes4 和5）。高分子量的条带表明可能是还原态菌丝霉素聚集原因。3.6一价和二价阳离子对菌丝霉素抗-金黄色葡萄球菌活性的影响单价阳离子对菌丝霉素抗金黄色葡萄球菌活性没有影响。当Na+或者K+浓度达到150mM时，对菌丝霉素活性几乎没什么影响，几乎保持100%活性，就算Na+或K+离子浓度达到300mM时，菌丝霉素活性依然保留97.7%。（Fig.6A） 二价阳离子对菌丝霉素抗金黄色葡萄球菌的活性依赖于二价阳离子的浓度。在Mg2+和Ca2+在生理浓度以下，观察到其对菌丝霉素活性的影响是有限的，当浓度达到1.56mM时，菌丝霉素抗经黄色葡萄球菌的活性被100%和92.4%的抑制（Fig.6B）.随着二价阳离子浓度的增加，菌丝霉素的活性下降的越显著（Fig.6B）.Ca2+对抗金黄色葡萄球菌活性的影响比Mg2+更敏感。Ca2+浓度达到6.25mM和12.5mM时，菌丝霉素分别能杀死64%和7.4%的金黄色葡萄球菌，然而，在相同浓度的Mg2+下，分别能杀死100%和90%的金黄色葡萄球菌（Fig.6B）.这些结果表明，二价阳离子，特别是Ca2+，相对于单价阳离子，在菌丝霉素抗菌活性上扮演着一个更重要的角色。Fig.3. 重组菌丝霉素柱上Xa因子切割后的纯化。（A）麦黄酮SDS-PAGE从硫氧还菌丝霉素融合蛋白中分离带组氨酸标签部分。Lanes1-6：经Xa因子0，6，12，24，48，96h孵化切割后，用200mM咪唑缓冲液进行洗脱标签部分蛋白。（B）麦黄酮SDS-PAGE从硫氧还菌丝霉素融合蛋白中分离目的肽，Lanes 1-6：用Xa因子作用0，6，12，24，48，96h后目地片段的洗脱状况。LaneM：蛋白分子质量标准。（C）质谱检测纯化的重组菌丝霉素。菌丝霉素表现出两个峰，相对分子质量为4399.12Da和4407.12D。Fig.4小分子物质对菌丝霉素溶解度的影响。等量的去盐菌丝霉素（1mg/ml）被溶解在两种溶剂中，0.01%醋酸缓冲液（Lanes 1-5）和TGE缓冲液（Lanes6-9），与小分（10%甘油，0.5M精氨酸，20%DMSO和10mMDTT）加入作为显示。室温下轻微振荡孵化24h后，离心（15000g，10min）取上清液，可溶性菌丝霉素经不含巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE分析。Table1 重组抗菌肽最小抑菌浓度和抗生素对细菌和真菌的最小抑菌浓度，“”表示没有检测Fig.5 氧化态和还原态的菌丝霉素。（A）氧化态和还原态菌丝霉素对金黄色葡萄球菌活性的影响。（a） 氨苄青霉素（100ug/ml，阳性对照）；（b）菌丝霉素（0.5mg/ml 溶于TEG缓冲液中）； （c）TEG缓冲液 （阴性对照）；（d）用20%DMSO处理的菌丝霉素；（e）含有20%DMSO的TEG缓冲液；(f)用10mMDTT处理过的菌丝霉素；（g）含有10mMDTT的TEG缓冲液；碟子（b）-（g）每个装40ul。（B）麦黄酮SDSPAGE分析氧化态和还原态的菌丝霉素。Lane1：20%DMSO处理的菌丝霉素；Lane2：菌丝霉素 Lanes3-5：经10mMDTT在37分别处理1h，4h和20h；LaneM：蛋白质分子质量标准 Fig.6 单价和二价阳离子对菌丝霉素抗金黄色葡萄球菌的活性影响4 讨论来源于脊椎动物，植物，无脊椎动物的防御素都通过融合蛋白表达的方式在大肠杆菌中成功表达。对于融合蛋白表达的一个重要挑战是目的肽段的自由释放。Xa因子能准确的识别位点并切割，并且没有残留多余的氨基酸残基，广泛用天源抗菌肽的生产。未经沉淀的融合蛋白柱上切割方法，与传统的酶切消化并纯化的方法相比，可以避免因洗脱和透析造成的融合蛋白损失。该方法已经成功用于抗菌肽的纯化。在这次研究中，富含Cys的菌丝霉素多肽在大肠杆菌中得到成功表达并经柱上切割法而纯化。通过凝胶电泳分析表明，有21KD的小蛋白分子条带被观察到，并通过Ni-NTA亲和色谱法纯化(Fig. 2B Lane S )。然而，21KD条带在后面的麦黄酮SDS-PAGE中无法检测到（Fig.A）。可溶性较小片段蛋白质可能是正常折叠或非正常折叠亦或通过一种未知的折叠方式形成非特异的二硫键造成，最后的结论有待进一步研究。蛋白质溶解度低是药物开发过程中普遍的问题。小分子物质，如甘油，精氨酸等，被广泛用来防止蛋白质的错误折叠和聚集。在此次研究中，向10%甘油的醋酸缓冲液中加入精氨酸可以提高菌丝霉素在其中的溶解度。重组菌丝霉素抗菌谱被认为对细菌和真菌有一定抗性。在体外实验中，菌丝霉素对革兰氏阳性细菌有强烈抗菌活性，但是对革兰氏阴性菌和真菌表现出有限的抗性或者根本就不起作用。这些结果与已有的报道相一致。Mygind等报道，菌丝霉素不仅对鼠成纤维细胞和人表皮角质化细胞没有毒性，而且对人红细胞没有溶血性。同样的，在此次实验中，菌丝霉素作用于家兔红细胞一样没有观察到溶血性。二硫键在稳定防御素结构上具有重要作用。二硫化物Crp4能保护多肽不被金属蛋白酶7所降解。人防御素二硫桥具有稳定分子结构和维持抗菌活性的功能。一些研究结果表明，防御素二硫键在抗菌活性中起到关键作用。对于Tenecin1，二硫桥是具有活性的前提。Campopiano等人得出结论表明，对Defr1二聚体亚型而言，分子间二硫键的形成能使其活性和稳定性增强。然而，一些研究也表明，防御素的抗菌活性与二硫键是相对独立的。吴等人最近证明，人防御素3的抗菌活性于二硫键无关，但是这一多肽的趋药特性依赖于二硫键的形式。Mandal等人报道表明，严格的折叠结构或三个二硫键并没有表现出很严格迫切的需求对于防御素的抗菌活性。我们对还原态和氧化态的菌丝霉素的研究结果表明，菌丝霉素最大抗菌活性在其片层三级结构中需要二硫键的结合。进一步的研究将关注这些差异。一些防御素，例如，哺乳动物防御素和鸟类防御素，被证明抗菌活性对盐敏感。尽管单价和二价阳离子对抑菌效果都有影响，但是这些抑制效应依赖于总的离子强度。一个高的离子强度可能阻碍了带正电荷防御素与带负电荷的微生物细胞膜表面的相互作用。然而，sphe2就算在高离子强度下依旧保持很高的活性。假设这种差异归因于抗菌肽净正电荷的差异。Sphe-2净正电荷（+11）比其他防御素要高，可能可以减少高离子强度对抗菌活性的影响。尽管菌丝霉素净正电荷（+3）低，但是它在相对较高离子强度的生理盐水中依然保持较高的抗菌活性。在这个研究中，菌丝霉素抗菌活性受Ca2+和Mg2+影响，但是不受单价阳离子的影响。我们的研究结果显示，菌丝霉素活性可能包括一个特定的表面相互作用，菌丝霉素与目标微生物表面相互作用，支持前人的研究，菌丝霉素直接作用与细菌细胞壁前体脂质II。详细探讨菌丝霉素，脂质II和二价阳离子之间的关系有待就一步的研究。 我们的结论，关于二硫键的作用和离子对重组菌丝霉素抗菌活性的影响，为进一步研究菌丝霉素抗菌机理和潜在药物开发的发展奠定基础。致谢本研究由国家自然科学基金支持(Nos. 31001026,30972125,30771574,30810303084)，和北京市自然科学基金支持(Nos.5093030, 5062031).参考文献1 Mygind PH, Fischer RL, Schnorr KM, Hansen MT, S鰊ksen CP, Ludvigsen S, et al.Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus. 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