氨基酸营养缺陷性筛选和鉴定.pdf

氨基酸营养缺陷性的筛选与鉴定 芽孢杆菌 实验目的 1 学习营养缺陷型突变菌株的筛 选 2 掌握营养缺陷型的诱变以及筛 选鉴定 芽孢杆菌芽孢杆菌 芽孢杆菌 芽孢杆菌 Bacillaceae 细菌的一科 能形 细菌的一科 能形 成芽孢 内生孢子 的杆菌或球菌 包括芽孢杆成芽孢 内生孢子 的杆菌或球菌 包括芽孢杆 菌属 芽孢乳杆菌属 梭菌属 脱硫肠状菌属和菌属 芽孢乳杆菌属 梭菌属 脱硫肠状菌属和 芽孢八叠球菌属等 它们对外界有害因子抵抗力芽孢八叠球菌属等 它们对外界有害因子抵抗力 强 分布广 存在于土壤 水 空气以及动物肠强 分布广 存在于土壤 水 空气以及动物肠 道等处 芽孢杆菌道等处 芽孢杆菌bacillus 杆菌科的一属细菌 杆菌科的一属细菌 实验原理实验原理 特性 1 繁殖快速 代谢快 繁殖快 四小时增殖10 万倍 标准菌四小时仅可繁殖6倍 2 生命力强 无湿状态可耐低温 60 耐高 温 280 耐强酸 耐强碱 抗菌消毒 耐高 氧 嗜氧繁殖 耐低氧 厌氧繁殖 3 体积大 体积比一般病源菌分子大四倍数 占据空间优势 抑制有害菌的生长繁殖 实验流程 诱变处理 淘汰野生型 营养缺陷型的检出 鉴定缺陷型 诱变方法 物理诱变 应用较多的是辐射诱变 即用 射线 射线 射线 射线 中子和其他 粒子 紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异 化学诱变 化学诱变除能引起基因突变外 还具有和辐射相类似的生物学效应 如引起 染色体断裂等 常用于处理迟发突变 并对某特定的基因或核酸有选择性作 用 化学诱变剂主要有 烷化剂 这类物质含有1个或多个活跃的烷基 能 转移到电子密度较高的分子中去 置换其他分子中的氢原子而使碱基改变 常用的有甲基磺酸乙酯 EMS 乙烯亚胺 EI 亚硝基乙基脲烷 NEU 亚硝基甲基脲烷 NMU 硫酸二乙酯 DES 等 核酸碱基 类似物 为一类与DNA碱基相类似的化合物 渗入DNA后 可使DNA复制发 生配对上的错误 常用的有5 溴尿嘧啶 BU 5 溴去氧尿核苷 BudR 等 抗生素 如重氮丝氨酸 丝裂毒素C等 具有破坏DNA和核酸的能力 从 而可造成染色体断裂 淘汰野生型菌株的方法有 抗生素法抗生素法 细菌用青霉素法 细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖 而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链 阻止合成完整的细 胞壁 处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感 因而被抑制 或杀死 但不能抑制或杀死处休止状态的细菌 将诱变处理后的 菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上 培养后野生型细胞由于 正常生长繁殖而被杀死 营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下 来 达到富集目的 酵母菌用制霉素法 制霉素作用于真菌细胞 膜上的甾醇 引起细胞膜的损伤 杀死生长繁殖过程的真菌 起 到富集营养缺陷型的作用 高温杀菌法高温杀菌法 利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性 的差异 让诱变后的细菌形成芽孢 然后把处在芽孢阶段的细菌 移到基本培养液中 振荡培养一定时间 野生型芽孢萌发 而营 养缺陷型芽孢不能萌发 此时将培养物加热到80 维持一定时 间 野生型细胞大部分被杀死 缺陷型则得以保留 起到了浓缩 作用 菌丝过滤法菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本 培养基中能萌发长成菌丝 而营养缺陷型的孢子则不能萌发 把 诱变处理后的孢子移入到基本培养液中 振荡培养10h左右 使 野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见 用灭菌的脱脂棉 滤纸或 玻璃漏斗除去菌丝 继续培养 每隔3 4h过滤一次 重复3 4 次 最大限度地除去野生型细胞 然后稀释 涂皿分离 营养缺陷型的检出 点植对照法法点植对照法法诱变后的孢子或菌体 经富集培养 涂布分 离在完全培养基平板进行培养 待菌落孢子成熟后 用灭菌 的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养 基和完全培养基平板上的相应位置 同时培养 然后观察对 比菌落生长情况 如果基本培养基上不生长而完全培养基相 应位置上生长的菌落 可能为营养缺陷型 挑取孢子或菌体 分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上 进一步复证 该法可靠性强 但工作量大 影印法影印法经富集后的孢子或菌体分离在完全培养基培养至菌落成熟 母皿 用灭菌后的特制 丝绒印模 在母皿平板菌落上轻轻一印 再转印到方位相同的另一基本培养基和完全培养基的平板上 培养后 观察比较菌落生长情况 凡是在基本培养基上不生长 而在完全培养 基上生长的菌落 分别移接到以上两种培养基斜面上进一步复证 另 外还可采用更简便的方法 以上印模从母皿中沾上菌体细胞后 仅影 印在基本培养基平板上 培养后 生长的菌落情况与存放于冰箱的母 皿菌落比较即可检出营养缺陷型 本法适用于细菌 酵母菌 其次对 小型菌落的放线菌和霉菌也适用 限量补充培养法限量补充培养法如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株 则 其该法是将富集培养后的细胞接种到含有0 01 蛋白胨的基本培养 基上 培养后 野生型细胞迅速地长成大菌落 在平皿底部作好颜 色标记 而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型 此称限量培养 如果 试验的目的是要定向筛选某种特定的缺陷型 则可在基本培养基中 加入某种单一的氨基酸 维生素或碱基等物质 称为补充培养 夹层培养法夹层培养法先在培养皿上倒一薄层基本培养基 凝固后再倒一 层经过诱变处理的菌液 其上再浇一层基本培养基 经培养后 对 首次出现的菌落用记号笔在皿底标记 然后再倒一层完全培养基 再培养 出现的形态较小的新菌落 多为缺陷型 实验内容简介 本实验以芽孢杆菌为实验材料 通过诱变处 理 本组采用紫外诱变处理 产生氨基酸营 养缺陷性菌株 再通过抗生素法淘汰野生型 菌种 用影印法检出缺陷性的菌株 并对缺 陷性菌株进行鉴定 实验材料 芽孢杆菌 细菌完全培养基 细菌基本培养基 无氮基本培养基 青霉素溶液 生理盐水 亚硝基胍溶液 补充培养基 基本培养基加混合氨基酸溶液 实验仪器 台式离心机 漩涡混合气 三角瓶 恒温培养箱 无菌生理盐水 无菌器皿 实验方法 菌种活化 菌悬液的制备 诱变育种 青霉素淘汰野生型 突变菌株的筛选及鉴定 菌种活化 将实验室保存的野生菌种接种到斜面培养 基培养24h 供扩大培养 菌悬液的制备 1 用灭菌的接种环将芽孢杆菌接种到盛有 完全培养液的250ml锥形瓶中 30 振荡 培养18 24h 2 取1ml过夜的培养液转接于另外盛有 20ml完全培养液的250ml锥形瓶中 30 振荡培养6 7h 使细胞处于对数生 长期 以便使其发生突变 诱变处理 选用亚硝基胍 NGT 为诱变剂 在碱性 时NTG能形成重氮甲烷 烷化DNA而使基因突 变 ph5 5 5时 NGT形成HNO2 本身也是诱 变剂 ph6 0时 NTG本身不变化 可作用于 核蛋白而引起诱变效应 诱变处理注意事项 NGT是一种超诱变剂 需要小心操作 称量药品时 戴好塑料手套和口罩 称量 完用完后立即烧毁 溶液外溢时 用沾浸硫代硫酸钠溶液抹布 擦洗 诱变处理后含NGT的磷酸缓冲液及稀释液 立即倒入浓NaOH溶液中 若手接触NTG 应立即用水冲洗 诱变处理 1 分别称取0 25mg 0 3mg 0 35mg 0 4mg亚硝基胍于4支无 菌离心管中 再加0 05ml 使完全溶解 用黑纸包好在37 水浴中保温 2 分别取4ml细胞悬浮液加入上述四只离心管中 充分混匀立 即置于37 水浴振荡处理30min 离心管中NTG的最终浓度分 别为50ug ml 60ug ml 70ug ml 80ug ml后 3500r min离心 10min 收集菌体 将含NGT的上清液倒入浓氢氧化钠溶液中 弃去 用无菌水洗涤菌体三次 以大量稀释法终止NTG的诱变 作用 3 将诱变处理洗涤过的菌液 加入装有20ml完全培养基的 250ml锥形瓶中 37 振荡培养过夜 抗生素淘汰法淘汰野生型 青霉素法 1 饥饿培养 吸取5ml处理过的菌液接入已经灭菌的离心管 离心 3500r min 10min 倒去上清液 打匀沉淀 加入 生理盐水 离心洗涤三次 加生理盐水到原体积 用无氮培 养基 30 振荡培养4 6h 2 加青霉素 将上述饥饿培养的菌液 3500r min离心 10min 加到二倍氮源20ml液体基本培养基中 30 振荡 培养3 4h 待野生型细胞刚刚进入对数生长期 加入青霉素 的浓度一般为50 100ug ml 同时加入无菌的20 蔗糖和0 2 MgSO4 再继续培养5 6h 达到淘汰野生缺陷型的目的 3 制备菌悬液 取10ml上述菌液 3500r min离心10min 弃上清液 菌体利用生理盐水洗涤一次 再加入10ml生理盐 水制备悬菌液 突变株的筛选 1 取无菌平皿两个 在地面外表用笔划分若干等分 分别编 号1和2 培养皿1中加入完全培养基 培养皿2中加入基本培 养基 室温凝固 2 于CM诱变平皿上选择微小型菌落 做好标记 然后用接种 环挑取单只菌落涂于培养皿1和2的同一位置 不断重复 接 种时应注意先划线于基本培养基 培养基2 然后划线于完 全培养基 培养基1 3 将划好种的两个培养皿置于37 培养48h 观察结果 如某 一菌落 在完全培养基上生长良好 在基本培养基上丝毫不 长 则为营养缺陷型 4 挑取营养缺陷型的菌落