第九章+干细胞.ppt

1 第十二章 干细胞 stemcell 2 第一节胚胎干细胞第二节成体干细胞第三节胚胎干细胞的诱导分化 本章内容 3 干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力 最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域 1999年干细胞研究被美国 科学 杂志评为1999年度世界十大科学之冠 2000年干细胞研究再次被 科学 杂志评为该年度世界十大科学成就之一 组织工程是以干细胞研究为基础发展起来 它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题 进展极为迅速 已经成为干细胞应用的主要方向 4 干细胞的概念 把那些具有自我复制能力 self renewing 并能在一定条件下分化形成一种以上类型细胞的多潜能细胞称为干细胞 stemcell SC 5 1981年Evans和Kaufrnan及Martin首次由小鼠中分离得到鼠的胚胎干细胞 至今已分离得到的胚胎干细胞物种有 金黄地鼠 1988 貂 1993 猪 1994 1997 鸡1996 恒河猴 1995 绒猴 1996 分离得到人的胚胎干细胞 1998 分离得到人的胚胎生殖细胞 1998 目前不断报道成年组织来源的的干细胞 6 干细胞 来源 分化潜能 全能干细胞 多能干细胞 专能干细胞 胚胎干细胞 成体干细胞 干细胞的类型 包括 胚胎干细胞和生殖干细胞具有全能性 能够分化成全身200多种细胞类型 进一步形成机体的任何组织和器官具有分化成多种细胞和组织的潜能 但却失去了发育成完整个体的能力 只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化 7 干细胞的特征1 形态特征和生化特征形态特征 圆形或椭圆形 核质比大 生化特征 较高的端粒酶活性 2 增殖特征增殖的缓慢性增殖的自稳性 区别与肿瘤细胞的本质特征 8 干细胞巢及其微环境 干细胞在机体内的居所称为干细胞巢 在干细胞巢中所有控制干细胞增殖与分化的外部信号构成了干细胞生存的微环境 如 分泌因子 受体介导的细胞间的相互作用 整和素及胞间基质等 9 第一节胚胎干细胞 ES细胞 一 胚胎干细胞的概念胚胎干细胞是指存在于早期胚胎中具有多向分化潜能的细胞 胚胎干细胞可以在体外无限扩增并保持未分化状态 具有分化为胎儿或成体各种细胞类型的潜能 10 二 胚胎干细胞的形态和生化特征 形态特征体积小 核大 有一个或多个核仁 胚胎干细胞克隆紧密堆积 无明显的界限 形似 鸟巢 11 生化特征具有碱性磷酸酶和端粒酶活性 表达SSEA 3 SSEA 4等 表达OCT 4蛋白 12 三 胚胎干细胞的分化潜能 胚胎干细胞给动物皮下注射形成胚胎组织瘤 瘤组织包括胃上皮 内胚层 平滑肌和横纹肌 中胚层 神经节 外胚层 胚胎干细胞和正常胚胎嵌合可以形成各种组织和器官 13 胚胎干细胞 神经细胞 脂肪细胞 心肌细胞 上皮细胞 体外定向分化 14 15 16 四 ES细胞分离材料的获取及处理方法 桑椹胚或囊胚为分离ES细胞的常用材料 一般来说 小鼠多选用3 5d囊胚 猪取9 10d囊胚 兔取3 5 4d囊胚 绵羊取8 9d囊胚 牛取6 7d桑椹胚或7 8d囊胚 人取囊胚约7 8d 17 1 延缓胚胎着床 通过摘除动物卵巢或给予外源激素而改变母体生殖激素水平 影响子宫内环境使胚胎着床延迟 Evans等 1981 从而获得延迟着床的胚胎 18 2 脱除胚胎透明带 通过胰酶或透明质酸酶等处理或机械切割的方法将透明带除去而得到裸胚进行培养 Graves 1993 Nieman 1994 赖学良 1995 19 3 分离ICM 目的是消除滋养层细胞对ICM的竞争性抑制增殖作用和分化诱导作用 方法免疫外科法 组织培养法或机械剥离法 20 4 离散卵裂球 将桑椹胚或囊胚ICM经胰酶消化并辅以机械方法分散成单个卵裂球后将卵裂球接种于饲养层上培养 Harald 1989 21 5 热休克处理 将发育桑椹胚或囊胚阶段的胚胎 从输卵管或子宫中冲取置于高于正常温度条件下处理一定时间 如41 60min 以增加ES细胞克隆率 Sukoyan 1988 22 五 原始生殖细胞的获取 在哺乳动物 原始生殖细胞最早出现于靠近尿囊基部的卵黄囊内胚层内 以后由于胚胎的纵向折转 卵黄囊的这部分成为胚胎的后肠 原始生殖细胞由此作变形动物 经背侧系膜向生殖嵴移动 Stewart 1994 因此 PGCs的获得主要是随其在早期胚胎中的迁移到相应的组织 如在小鼠取12 5d胎儿生殖嵴 大鼠可取10 5d尿囊中胚层 12 5d背肠系膜及13 5 14 5d生殖嵴 牛取29 35d胎儿生殖嵴 猪可取24d背肠系膜或25d生殖嵴 人取5 9周龄胎儿生殖嵴或背肠系膜 23 1 机械分离法 采集动物的生殖腺及其周围组织 用含胎牛血清 fetalcalfserum FCS 的PBS或培养液 如DM EM Whittingham氏 TCM199 MEM等培养液 冲洗数次 然后用细针刺扎生殖腺或者用硅化玻璃压碎 研磨生殖腺 使细胞释放出来 Mclaren 1986 Leichthammer 1990 制成细胞悬液 进行分化抑制培养 24 2 酶消化分离法 1 可用胶原酶处理分离PGCs 将取出的生殖腺 冲洗多次 移入1ml新制备的I型胶原酶溶液的塑料管中 室温下孵育15min 弃去胶原酶溶液 用含有10mg mLDNA酶的无钙镁培养液冲洗生殖腺三次 然后吹打数次 使组织充分解聚 所得细胞悬液几乎都为单个细胞 DeFelici 1982 调整浓度后 接种在饲养层上进行分化抑制培养 2 或用0 05 胰酶 0 008 EDTA处理分离PGCs 25 六 ES细胞的分化抑制培养 在进行ES细胞的分离培养首先需要解决的问题是阻止引起分化的基因的激活与表达 以实现分化抑制 保证细胞的全能性 与此同时给予适当的营养物质或生长因子等以促进其增殖 保证在量上对ES细胞的需要 26 一 分化抑制物物的选择 目前带用的分化抑制物有三种 包括饲养层 feederlayer 条件培养基 conditionedmedium CM 和分化抑制因子 differentiationinhibitoryactivity DIA 1 饲养层饲养层是将所选用的细胞 如成纤维细胞 输卵管上皮细胞 子宫上皮细胞 大鼠肝细胞 睾丸细胞等 以丝裂霉素C阻断有丝分裂后制成的细胞单层 饲养层细胞可合成并分泌促有丝分裂因子 如成纤维细胞生长因子 fibroblastgrowthfactor FGF 抑制细胞分化是因为饲养层细胞分泌白血病抑制因子 leukemiainhibitoryfactor LIF 等细胞分化抑制因子 这些细胞因子通过与培养细胞表面受体结合而发挥作用 27 2 条件培养基 条件培养基是通过培养的细胞分泌到培养基中的生长因子 刺激全能性 或多能性 细胞增殖和抑制其分化而发挥作用 条件培养基的优点在于其可消除饲养层细胞的干扰 免受丝裂霉素C影响 易于进行操作 并且还可以对ES细胞分化的启动和关闭机制进行进一步分析 28 3 分化抑制因子 LIF是常用的ES细胞分化抑制因子 ES细胞分化抑制是多种因子共同作用的结果 其中起主导作用的是白血病抑制因子 因其可诱导小鼠白血病细胞分化并抑制其增殖而得名 29 二 基础培养基的选择 ES细胞需要同时满足抑制分化和促进增殖两个条件 文献报道中常用的基础培养基有MEM a DMEM TCM 199 F 12等合成培养基 30 三 添加物的选用 目前常用作细胞培养基添加成分的物质有血清 各种生长因子 非必需氨基酸 核苷酸 2 巯基乙醇 柠檬酸 亚硒酸钠 丙酮酸钠等 31 七 ES细胞系的建立与保存 一 ES细胞的克隆及常规培养分离到ES细胞克隆后 需要对ES细胞克隆进行扩增或继代培养 ES细胞最初的继代培养是将ES细胞克隆以胰酶 EDTA消化液消化并辅以机械方法将之离散成小细胞块后进行分化抑制培养 此过程也是对分离到的ES细胞进行筛选的过程 经最初几次继代培养筛选之后 至出现大量增殖的ES细胞克隆时 则将ES细胞消化成单细胞进行继代培养 ES细胞系一旦建立 便迅速生长增殖 约18 24h分裂一次 ES细胞培养时需保持较高的密度以维持较高的分裂率 同时减少细胞自发分化 培养的ES细胞一般需每两天更换一次培养液 并且间隔3 4d即需传代一次 在传代过程中尤其应注意将细胞消化成单细胞悬液 因为细胞团的存在可刺激细胞分化并产生内皮样细胞克隆 32 七 ES细胞系的建立与保存 二 ES细胞的冷冻与解冻与其它建系的细胞一样 经长期培养 ES细胞会出现变异 核型出现异常 细胞存活数目与克隆率也相应减少降低 因此在ES细胞建系后 以及早期传代中 需要不断加以冻存 到使用时再将其解冻 用胰酶消化获取ES细胞 进行细胞计数后低速离心 1000r p m 5min 之后将细胞重新制成悬液 并等量加入冷冻培养基 20 DMSO 20 FBS 60 DMEM 使细胞浓度在5 106 107 个 ml 迅速将悬液装入冷冻管并置于液氮罐气相中 70 在24h之后 再将冷冻管投入液氮 解冻时 由液氮中将冷冻管取出并直接投入37 温水中以70 酒精消毒冷冻管外壁后 将内容物移入10ml离心管中 在离心管中缓慢加入5ml细胞培养液 摇匀 低速离心 1000r p m 5min 之后吸出上清 用培养液洗一次 以除去DMSO 以培养液重新制成悬液 将悬液移入培养皿中置培养箱中培养 33 八 ES细胞的生物学特性及鉴定 一 ES细胞形态结构 核型特征及形态学鉴定和核型分析 ES细胞的形态结构 胞体体积小 核大 有一个或几个核仁 和生长特性 呈克隆状生长 细胞紧密聚集 形似鸟巢 界限不清等 对ES细胞鉴定 胚胎干细胞克隆 34 二 ES细胞的高度分化潜能及分化能力检测 ES细胞的多能性和全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点 ES细胞在体外培养时 一旦脱离分化抑制机制就自发地进行分化 1 体外分化试验如所得细胞系为ES细胞 则在培养过程中部分细胞聚集贴壁 培养一段时间后将分化为神经 肌肉 软骨等不同组织的细胞 同时还有部分不贴壁悬浮生长 先形成简单类胚体 进一步培养形成囊状胚体 35 二 ES细胞的高度分化潜能及分化能力检测 2 体内分化试验以一定量所获得细胞注射到同源动物的皮下 如该细胞为ES细胞 经过一段时间以后 动物皮下注射处可见有组织瘤生成 手术取瘤 常规制作切片观察 一般可见代表三个胚层的不同组织细胞 36 二 ES细胞的高度分化潜能及分化能力检测 3 嵌合体形成将ES细胞通过注射法或聚合法与受体胚胎结合并将胚胎移植同期化受体可以得到嵌合体动物 嵌合体动物可以通过毛色 皮肤色素等进行判断 或取器官组织进行同工酶 如GPI 磷酸葡萄糖异构酶 检测 ES细胞是否参与生殖系嵌合且形成功能性配子可以通过是否形成同种或同品种后代确定 4 核移植以ES细胞作核供体注射到去核卵母细胞中 观察重构胚是否正常发育并经移植受体产生个体 37 三 碱性磷酸酶的表达 碱性磷酸酶 AKP 常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一 可用AKP染色的方法进行AKP检测 38 四 胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达 早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原 SSEA 1 39 SSEA I免疫荧光标记第1抗体 SSEA 1 鼠抗ES细胞单克隆抗体 1 100稀释 第2抗体 羊抗鼠1 10稀释 封闭液 羊抗兔lgG 步骤 杜氏PBS洗3次 2 Triton作用20min 再以杜氏PBS洗3次 封闭液中置20min 以杜氏PBS洗3次 加第1抗体于4 过液 以杜氏PBS洗3次 加第2抗体于30 温箱置30min 再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片 样本在激光共聚焦图像系统下观察 结果依细胞是否出现荧光作出判断 40 五 Oct 4转录子表达产物 转录因子Oct 4在多能胚胎干细胞和原始生殖细胞中得到表达 当全能细胞分化形成体细胞或胚外组织时 该基因则不再表达 原始生殖细胞是原肠胚形成之后唯一表达Oct 4基因的细胞 Oct 4基因在维持ES细胞和原肠胚阶段原始生殖细胞全能性表型起着非常重要的作用 我们可以Oct 4基因的存在与否作为ES细胞鉴定的指标之一 41 六 ES细胞的端粒酶活性 生殖细胞 胚胎细胞 干细胞和肿瘤细胞具有较高的端粒酶活性 随着机体组织 细胞的分化 端粒酶活性逐渐降低 所以正常体细胞一般无端粒酶活性 42 43 ES研究面临的难题 1 体外培养ES细胞应当是既能快速无限增殖 又呈未分化状态 如何平衡这一对矛盾 必须筛选适宜的培养条件 目前在ES细胞研究中存在着建系成功率也不高等问题 只在小鼠中建立了稳定的ES细胞系 家畜 人类细胞系建立的最佳条件仍无定论 44 2 ES细胞高度未分化 具有形成畸胎瘤的可能性 因此在使用ES细胞进行治疗前必须首先体外诱导ES细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因 当移植的细胞向肿瘤发展时 自杀基因能启动自毁机制使其凋亡 但如何诱导ES细胞定向分化成单一类型的分化细胞 是至今仍未解决的难题 因此 必须寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法 以及不同干细胞的表面标志和分选技术 从而得到所需要的细胞或组织 45 3 ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破 因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程 很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的 即便是发育完整的来自自然机体的器官 要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到 器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题 46 4 最大的障碍来自于伦理学问题 特别是ES细胞应用受到伦理 法律 宗教以及社会因素的强烈反对 有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究 无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看 人类ES细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响 但随着观念的改变 人们会逐渐认识到ES细胞对临床医学及生物学理论研究的重要作用 47 胚胎干细胞的伦理学问题 禁止用人干细胞和动物胚胎结合产生嵌合生物 禁止用胚胎干细胞制造人胚胎 禁止用人工受精的囊胚建立新的胚胎干细胞系 允许用已经建立的胚胎干细胞系进行后续研究 允许用流产儿建立新的胚胎干细胞系 48 第二节成体干细胞 一 成体干细胞的概念成体干细胞是在成体组织内具有自我更新能力及能分化产生一种或一种以上子代组织细胞的未成熟细胞 49 50 二 成体干细胞的特点数量少 难以识别 分离纯化 体外培养时不能长时间增殖 具有可塑性 神经干细胞 造血干细胞 51 三 几种成体干细胞 1 造血干细胞2 间充质干细胞3 神经干细胞4 表皮干细胞5 肝干细胞 52 造血干细胞 HSCs 什么是造血干细胞造血干细胞是从血液或骨髓中分离到的具有以下一些特性的细胞 能自我更新 能分化成一些具有组织特化的细胞 能从骨髓中游离出来进入血液循环 能发生程序性死亡的细胞 53 2 造血干细胞的来源 骨髓 1 400外周血 1 100000脐带血 1 10000脾脏 淋巴组织 54 脐带血干细胞 脐带血干细胞是指将没有经病毒和细菌污染的脐带血 经过抗凝处理 用分离液分离出的造血干细胞 它经过培养后可经静脉输给病人 胎盘脐带血含有丰富的造血干细胞 其单位体积的含量比骨髓和外周血含量还高 由于它还含有造血基质细胞和造血刺激因子 对造血干细胞的繁殖 分化 成熟有十分重要的作用 因而能维持人体内相对恒定的血细胞数量和功能 保证机体的生命活动 55 间充质干细胞 mesenchymalstemcell MSC 来源 附着在骨髓窦的内腔面功能 分化为骨 关节 脂肪 肌腱 肌肉和骨髓基质等多种组织 地塞米松 1 25 羟基维生素D3 细胞因子bFGF等 可诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞 成软骨细胞及脂肪细胞 两性霉素B和5 氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞分化为肌细胞和肌小管 在促进神经生长类因子的作用下 间充质干细胞可分化为神经细胞和星形胶质细胞 56 神经干细胞 neuralstemcell NSC 以往认为 哺乳动物包括人神经系统的神经细胞在出生后不久就丧失其再生能力 成人脑细胞一旦损伤就不能再生 然而 近年来神经干细胞 neuralstemcell