SDS-PAGE原理、试剂配制和注意事项.doc

SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺加速剂实验材料1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）：将60ml水预热至37摄氏度，加入丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，溶解并补水至100ml。用0.45微米孔径滤纸过滤，查证溶液pH值不超过7.0。贮棕色瓶中于4保存，可用一个月。（Acr）29.2g及（Bis）0.8g丙烯酰胺（Acr）及甲叉丙烯酰胺（Bis）有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积效应。称量时应戴手套和口罩。2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4贮存。3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4贮存。100ml分离胶1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：将Tris18.171g完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至8.8，加水定容至100ml。室温保存。100ml积层胶1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：将Tris12.114g完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至6.8，加水定容至100ml。室温保存。4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：5*存储液：在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，加入50ml 10%（w/v）SDS（电泳级）存储液（SDS 5.g），用去离子水补至1000ml。pH 8.3。5、10% 过硫酸铵（AP）：过硫酸铵0.1g于1.5ml进口EP管中，用时加1ml去离子水溶解。2周内使用。6、10%SDS（十二烷基磺酸钠）：在900ml水预热至68摄氏度，加入100g电泳级SDS溶解，补水至1000ml。SDS颗粒易扩散，称量时戴面罩。10%SDS无需灭菌。室温保存。7、四甲基乙二胺（TEMED）：10% TEMED 0.1ml TEMED , 加0.9 ml蒸馏水。8、上样缓冲液 取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。样品缓冲液：5ml1mol/l的Tris-HCl（pH6.7），2.5gSDS,1ml巯基乙醇，0.05g溴酚兰，10g蔗糖，加水定容至100ml。2样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝0.0202g，1MTrisCl（pH6.8）1ml巯基乙醇0.14ml，10%SDS 4ml。2上样缓冲液（10ml）：0.6ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，4ml 50%的甘油，2ml 10% SDS， 2ml 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT），1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水，可在4存放数周，或在-20保存数月。2上样缓冲液（10ml）：1ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，2ml 100%的甘油，4ml 10% SDS， 2ml 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT），0.02g溴酚蓝，1ml去离子水，在-20保存数月。9、考马斯亮蓝R250染色液：45ml去离子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液，溶解0.25g考马斯亮蓝R-250，加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。用Whatman 1号滤纸过滤染液去除颗粒物质。不可隔夜以免影响染色效果。10、脱色液：45ml去离子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液。取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。考马斯亮蓝脱色液：10ml甲醇，10ml冰醋酸，80ml蒸馏水。11、蛋白质分子量标志物：市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择5种以上的已知分子量蛋白质自行配制，注意其分子量分布要能满足需要，各种蛋白质的浓度基本相等。配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液溶液成分总体积 5ml总体积 10ml总体积 15ml总体积 20ml总体积 25ml总体积 30ml6%水2.6ml5.3ml7.9ml10.6ml13.2ml15.9ml30%丙烯酰胺1.0ml2.0ml3.0ml4.0ml5.0ml6.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.004ml0.008ml0.012ml0.016ml0.02ml0.024ml8%水2.3ml4.6ml6.9ml9.3ml11.5ml13.9ml30%丙烯酰胺1.3ml2.7ml4.0ml5.3ml6.7ml8.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.003ml0.006ml0.009ml0.012ml0.015ml0.018ml10%水1.9ml4.0ml5.9ml7.9ml9.9ml11.9ml30%丙烯酰胺1.7ml3.3ml5.0ml6.7ml8.3ml10.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml12%水1.6ml3.3ml4.9ml6.6ml8.2ml9.9ml30%丙烯酰胺2.0ml4.0ml6.0ml8.0ml10.0ml12.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml15%水1.1ml2.3ml3.4ml4.6ml5.7ml6.9ml30%丙烯酰胺2.5ml5.0ml7.5ml10.0ml12.5ml15.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液溶液成分总体积 3ml总体积 4ml总体积 5ml总体积 6ml总体积 8ml水2.1ml2.7ml3.4ml4.1ml5.5ml30%丙烯酰胺0.5ml0.67ml0.83ml1.0ml1.3ml1M Tris(pH 6.8)0.38ml0.5ml0.63ml0.75ml1.0ml10% SDS0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08ml10%过硫酸胺0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08mlTEMED0.003ml0.004ml0.005ml0.006ml0.008ml四、实验方法1、用1琼脂将长玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12分离胶（15ml），凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm（距梳子齿约0.5cm），接着在分离胶溶液上轻轻覆盖约1cm高的蒸馏水以封胶。约30min后，若在分离胶与水层之间可见一个清晰的界面，表明凝胶已聚合。将水倒出，吸干，灌满5浓缩胶（8ml，4ml用于Mini-Protein 型电泳槽）后立即插入梳子，冷凝30分后取出梳子。2、预电泳：将1X电泳缓冲液加入内外电泳槽，使凝胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液内；接通电源，上槽为负极，下槽为正极，80V预电泳35min。3、取20-30l蛋白提取液与20-30l样品缓冲液混合，于100水浴加热3-5min使蛋白变性（离心 510s），用微量进样器以50l的量注入点样孔，不加样槽注入样品缓冲液。取20ul收集液，加入5样品缓冲液5ul，在80水浴锅中煮5min。取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml，混匀，在沸水中煮沸5min。4、打开电源将电压调到80v，待样品跑过压缩胶后将电压调到120150v至电泳到胶底部为止。5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇23h（染色时间需根据凝胶厚度适当调整）；待条带清晰后倒出染色液，凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液23次，震荡达24h以上。将电泳后的凝胶取出，置于培养皿中，用蒸馏水冲去残留缓冲液，加入染色液将凝胶完全浸泡其中，放入微波炉内，高火档照射20秒，停留1min，再照射10秒，反复几次至凝胶上色后倒出染色液，用蒸馏水冲去残留染色液，加入脱色液，高火档照射20秒，倒出脱色液，再加入新鲜脱色液照射20秒，重复56次，直至背景清晰透明，于凝胶分析仪上成像分析。【注意事项】1. 凝胶不聚合的可能原因（1）试剂质量差，应使用电泳级别的试剂。（2）过硫酸铵和TEMED的量不够或失活，可增加剂量或重配新鲜的储存液。（3）凝胶聚合时温度太低，应以室温为宜。2 上样时，样品不能沉到加样孔底部，可能是上样缓冲液中甘油含量不足；或是加样孔底部留有聚合的丙烯酰胺。3 经过煮沸的样品虽然可以在-20保存数周，但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20取出的样本，上样前应先升至室温，确保SDS沉淀溶解。4 注意避免电泳条带弯曲畸变：“微笑” 现象，可能是因为凝胶中间部分温度过高，降低电压便可得到改善.“皱眉”现象，常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀。“拖尾”、“纹理”现象，则多为样品溶解不佳，增加蛋白样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即可克服。（主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。）“晕轮”效应（holo effect）多为加样过量所致。 5 非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成，应将染料溶液过滤后再用。6 如果电泳后将对蛋白质进行定量检测，须特别注意：1）已知和未知样品必须使用相同的溶剂系统、相同的浓度、相同的加样量，并在同一块凝胶上电泳和染色。2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 9. 什么是“