免疫组化法实验操作步骤

免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。一、病例资料和实验分组标本：经10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4m厚切片编号备用。二、试剂及免疫组化方法2.1 实验试剂：xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。抗体1,抗体2。二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。2.2 仪器 (1)10l、100l、200l、1000l可调微量加样枪（2）4冰箱(3)光学显微镜(4)恒温水浴锅(5)恒温烤箱(6)电热蒸馏水器(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。2.3 主要试剂的配置（1）0.01M PBS(PH7.4)缓冲液NaCl9.0 g磷酸氢二钠2.901 g磷酸二氢钠0.296 g加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。充分混合（2）0.01mol/L柠檬酸盐溶液（PH 6.0）A液：0.1M柠檬酸溶液(4保存)29.01g柠檬酸1000ml ddH2OB液：0.1M柠檬酸钠溶液(4保存)29.41g柠檬酸钠1000ml ddH2O缓冲液现用现配（1000ml 0.01 mol/L）A液（18ml）+B液(82ml) 900ml dH2O充分混合，调整PH 6.0，充分混合，调整PH 6.0（3）3%H2O230%H2O2：甲醇=1：9(4)0.1%Triton的配制Triton原液 0.1 ml0.01PBS液 99.9ml4保存备用。（5）5%羊血清的配制（1ml）羊血清 50l0.1%Triton 950l4保存。2.4免疫组化方法(1)石蜡切片60烤箱烤片30min.(2)石蜡切片常规脱蜡二甲苯15min - 二甲苯15min -无水乙醇15min - 无水乙醇5min - 无水乙醇 5min - 95%乙醇5min - 90%乙醇5min - 80%乙醇5min - 70%乙醇5min -蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中？）。（3）抗原修复：切片浸入沸腾的盛0.01M柠檬酸缓冲溶液（PH 6.0）的压力锅内盖上锅盖，加上压力阀，继续加热至喷气，开始计时2min后，离开热源自来水冲洗至室温。取出切片，蒸馏水冲洗2次，每次3min。（4）0.01MPBS液冲洗5min，2次(5)甩去PBS液，每张切片滴加1滴（50l）3%H2O2室温孵育10min(目的：阻断内源性过氧化物酶活性)(6)PBS冲洗5min，3次(7)甩去PBS液，每张切片滴加1滴（50l）羊血清室温孵育10min。(8)甩去血清。a:每张切片滴加1滴X抗体（50l），4过夜（约18h）b: 每张切片滴加1滴X抗体（50l），室温过夜（约20）(根据不同抗体选择不同温度、时间过夜)(9)室温下孵育 45min，PBS液漂洗5min，3次(10) 甩去PBS液，每张切片滴加1滴（50l）聚合物增强剂（A剂），室温下孵育20min(11) PBS冲洗5min，3次(12) 甩去PBS液，每张切片滴加1滴（50l）聚合物增强剂（B剂），室温下孵育30min(13)PBS液漂洗5min，3次（14）甩去PBS液，每张片滴加2滴新配置的DAB溶液，显微镜下3-10min，观察显色情况(15)自来水冲洗(16)梯度酒精脱水：70%-80%-90%-100%-100%，每次10min(17)脱色：二甲苯-二甲苯，每次30min(18)中性树脂胶封固。（怎么