糖工程和壳寡糖简介.doc

糖工程与壳寡糖彭皓，赵芳芳，张艳芳，刘媛婷，中泰和（北京）科技发展公司摘要：壳寡糖时天然寡糖中唯一大量存在的带正电荷的碱 性氨基多糖，由于其同事具有游离的氨基和羟基，故具有很多特殊的生理活性。本文将从壳寡糖与糖工程的关系、糖的分类、壳寡糖与甲壳素和壳聚糖的区别、壳寡糖的理化性质和生理功能及在各行业中的应用现状及其在畜牧行业中的兴起加以阐述。关键词：糖，壳寡糖，糖类是自然界中最丰富的生物分子，也是科学家最先研究的生物分子之一。但是由于糖类结构复杂，功能又相对简单，致使糖类研究在半个多世纪中几乎处于停滞状态。直到20世纪末期在核算研究的带动下，糖类的研究才迎来了一个发展期，而这个崛起的代表是糖生物学！糖生物学，是研究糖类在生物学中的租用，阐明在生物学中诸多与糖类有关的现象，由英国科学家德威克（Dwek）等在1988年提出这一新概念。研究的主要内容包括三方面：首先是糖类的结构研究；其次是糖类的生物合成和代谢；最后是糖类的功能。而糖工程的基础研究则包括了糖化学和糖生物学【2】。糖工程学，国际上诞生于20世纪90年代，是研究糖链结构、功能和代谢调控及其应用一门学科，与蛋白质工程和基因工程等学科同属于生物技术范畴，而糖链是生命科学的下一个重点研究对象！糖工程涉及内容包括：天然功能糖链发现及开发利用（如壳寡糖、甘露寡糖等）；糖药物的重组工具、表达系统、宿主和载体、宿主细胞的糖基化工程；糖蛋白生产系统、天然糖蛋白的糖信号及其在体内的命运和靶向性等【1】。通过最近几十年的研究，目前我们对糖工程在功能糖的发现、开发和利用方面已经得到了充分的研究，并加以应用推广。一、糖的分类糖类在自然界中广泛存在，并且是最丰富的可再生资源。糖类化合物按其组成分为三类：单糖、低聚糖和多糖。单糖： 不能被水解为更小分子的糖属于单糖。自然界中的单糖以含四个、五个和六个碳原子的最为普遍。 低聚糖：含有210个单糖单位，彼此以糖苷键连接，水解以后产生单糖。低聚糖又叫寡糖。自然界以游离状态存在的低聚糖主要有二糖如麦芽糖、蔗糖和乳糖，三糖如棉籽糖。 多糖：由许多单糖分子或其衍生物缩合而成的高聚物称为多糖，又称为高聚糖。可分为同多糖和杂多糖两类，如淀粉、纤维素、透明质酸、硫酸软骨素等。结合多糖（或复合多糖）： 糖与其它非糖物质共价结合形成结合多糖（复合多糖）或糖缀合物，例如蛋白聚糖、糖脂、糖蛋白等。糖类有很多种，研究比较多的有甘露糖、半乳糖、木糖、果糖等等，而功能研究的较为透彻、应用也相对较为广泛的则是寡糖，而寡糖中研究最多的就是壳寡糖【1】。二、壳寡糖与甲壳素、壳聚糖的关系与区别壳寡糖的来源主要看甲壳素的来源和分布情况。甲壳素是仅次于纤维素的第二大量的天然有机化合物，估计自然界每年生物合成的甲壳素约有100亿吨，广泛的存在于低等动物的甲壳、某些真菌和植物的细胞壁中。壳寡糖与壳聚糖是由天然产物甲壳素经过化学和/或酶学处理而得到的产物。甲壳素也称几丁质，在自然界中的总生物质量仅次于纤维素，广泛存在与真菌细胞比中，也是低等动物表面的主要组成部分。一般约有5000个糖基组成，即分子量约为1000kDa，它的功能主要起到的是一种结构保护作用。壳聚糖，具有很多功能，是由甲壳素经过浓减或酶的作用下脱乙酰基后的产物，一般乙酰基脱去55%以上可称之为壳聚糖，而有实用价值的壳聚糖脱乙酰基必须在70%以上，其主要用途是作为辅助性治疗药剂及功能性保健品的添加剂。壳寡糖，是壳聚糖的降解产物（聚合度在2-10之间），通常其聚合度控制在20以下。壳寡糖原料丰富多样，而且是目前仅知的唯一碱性寡糖。而在制备壳寡糖时要注意其脱乙酰基的程度，否则将难以判断其作用的主导因素【1】【3】。三、壳寡糖的理化性质与生理功能3.1. 壳寡糖的理化性质壳寡糖（COS）又称低聚葡萄糖胺、低聚氨基葡萄糖等，具有独特的生物活性。本文中所讲的壳寡糖时指聚合度为2-10的氨基葡萄糖聚合物。壳寡糖由210个氨基葡萄糖通过-1,4糖苷键连接，是目前自然界中发现的唯一呈碱性、带正电荷、分子量在2000Da以内，水溶性、动物性纤维寡糖，它在胃肠道中不被分解，可被动物直接吸收入血作用于靶细胞，持续稳定的提高动物机体免疫力。壳寡糖可以将特有信息以化学传递方式调节靶细胞的功能，起着信使的作用，在信息传递后，即被排除体外，安全、无毒、无残留。此外壳寡糖具有螯合作用，所以可作为机体内重金属离子的清除剂。同时还可以再壳寡糖分子中引入不同性质和功能的官能团，可或得独特功能的衍生物，从而进一步拓宽壳寡糖的应用领域。【1】由于不同分子量的壳寡糖其生理活性差异很大。因此壳寡糖产品质量的评价指标，除了常规的水分、灰分、糖含量等以外，还必须检测产品的平均分子量和各聚合度寡糖的含量。3.2. 壳寡糖的生理功能 由于分子量较小，水溶性好，易为机体吸收，壳寡糖具有很多生物活性。在此我们主要简绍一下与人体和农林牧渔行业有关的壳寡糖主要的生理功能。3.2. 1 抗氧化作用 壳寡糖具有良好的抗氧化作用，由于能够有效的清除机体内的自由基的作用，因此能够有效的保护肝脏、降低细胞损伤等方面的作用。 Kim 等（2002）运用ESR电子自旋共振光谱对不同脱乙酰度、不同分哪个的子质量壳寡糖的自由基清除活性进行了研究，表明，壳寡糖对DPPH、羟自由基、超氧自由基和以碳为中心的自由基都具有一定的清除作用。此外，在动物体内对壳寡糖的抗氧化作用发现，其作用机理可能是通过饲喂壳寡糖，激活了肝脏内抗氧化防御系统达到降低氧化损伤的目的，同时在离体研究中壳寡糖都展现了很好的抗氧化作用。而在进一步的分析壳寡糖在体内保护内皮细胞抵抗过氧化氢引起的氧化压力发现，壳寡糖的这种保护作用是由于其一直了过氧化氢引起的细胞周期阻滞和细胞凋亡【23】。壳寡糖与茶多酚（TP）和维生素C（VC）的双向作用相比，COS表现出长效抗氧化性。壳寡糖对CCL4、酒精导致的大、小鼠的急、慢性肝损伤具有保护作用，这主要是通过增强SOD等抗氧化酶活性来实现的。因此壳寡糖在抗氧化的同时达到了保护肝脏的作用【6】【22】。3.2. 2 双向免疫调节 壳寡糖能够有效的改善机体的免疫能力，提高机体和畜禽的健康水平，既能激活提高机体的免疫水平，有能够反向抑制由于免疫过激所带来的炎症反应。壳寡糖可以最大限度的释放免疫因子，激活包括中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等多种免疫细胞，使体液向碱环境偏移而激活免疫淋巴细胞，将LAK细胞的功能提高3倍左右、NK细胞活性提高约4.5倍。与其他的免疫增强剂相比，壳寡糖具有生物可降解性和生物相容性，故无毒副作用。壳寡糖对免疫的调节作用在养殖动物（畜、禽和水产）中体现的尤为明显(J Sci Food Agric 2007, 87:153159)。而当机体防御过激损伤机体组织、发生炎症时，壳寡糖可以抑制肥大细胞、吞噬细胞、内皮细胞炎症反应，促进其细胞的凋亡。因此壳寡糖具有提高机体免疫水平的作用，也可以帮助机体在免疫过激时抑制炎症的发生，具有自身双向调节，从而保证机体处于最佳的抵抗力水平（Carbohydrate Polymers 84 (2011) 13911398）。【7】【16】【19】3.2. 3 促进肠道健康 壳寡糖能够促进肠道的健康水平，提高畜禽对日粮的消化吸收利用率，从而起到改善畜禽生产能力的作用。壳寡糖能明显增加小肠绒毛的密度和高度，可以作为乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌的益生原，有增加乳酸杆菌数量、改善肠道菌群的作用，有利于对营养物质的吸收，其中总能、粗蛋白、钙、磷、脂肪等的吸收利用都有不同程度的增加，钙、磷的吸收增加较为明显. (Journal Animal Science (2008)86: 2609-2618)。而近年来又有实验证明，壳寡糖有抑制病原菌对肠道治病大肠杆菌（O111:H27, O119:H4和 O128:H12)结肠细胞的粘附(Carbohydrate Polymers 64 (2006) 5759)作用。【9】【11】【15】3.2. 4促生长壳寡糖在改善肠道健康的同时，能够在一定程度上改善畜禽的生产性能，促进生长。壳寡糖能增加仔猪血清中生长激素（GH）和胰岛素样生长因子（IGF-）的量，并对仔猪肝脏和肌肉中的IGF-的mRNA表达情况进行检测后发现，肝脏和肌肉中的IGF-的mRNA表达量明显上调。GHIGF-信号通路是调控生长的主要信号通路，GH与细胞表面的GH受体结合，进而活化JAK2、PI3K、STAT-5b等通路，最终调控转录水平上IGF-的表达，IGF-再与其受体结合，开启ERK1/2和PI3K通路，最终促进生长，可见壳寡糖是通过参与GHIGF-信号通路来达到促进动物的生长作用。【12】【16】【17】3.2. 5增强骨密度由于壳寡糖能促进机体对钙、磷的吸收能力，增殖骨细胞，从这一方面改善了骨骼的硬度，使得机体的健康水平进一步的得到了提高。骨形态发生蛋白（BMP）是成骨细胞分泌的一种重要的细胞因子，能诱导血管周围游走的、未分化的间充质细胞分化增殖为骨质细胞，。而壳寡糖通过抑制破骨细胞的再吸收，促使成骨细胞的活性增强，防止骨密度的降低，使得BMP在骨折修复早期表达增强，从而促进骨折的修复愈合。【13】【14】据报道，壳寡糖和磷酸化壳寡糖均有加速钙吸收，相对分子量在1000以下的磷酸化壳寡糖具有较强的抑制磷酸钙沉淀的作用，从而达到增强钙吸收率的目的。【1】3.2.6抗菌活性 壳寡糖在改善体积健康水平时，不仅仅因为其具有改善机体免疫水平的能力，同时还因为其具有一定的抑菌能力。在农业上可以用含有壳寡糖的产品来对抗真菌，也有研究表明壳寡糖等还有可能应用于动物健康和水产业等。在刘碧源（2003）对壳寡糖的研究中表明，其抗菌活性随其浓度的增加而增加。而在Jone等（2000a、2000。b）对壳寡糖抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和乳酸菌的活性研究中表明，其抑菌活性很大程度上与聚合度、分子量大小有关，高分子量的壳寡糖显示出了较高的抑菌活性。【5】【10】【20】3.2.7降血脂壳寡糖能有效清除体内的部分自由基，从而使得其具有良好的抗氧化能力，对于保护组织的健康、完好有一定的作用。刘亮亮等对酒精性肝损伤小鼠研究证明，与酒精性肝损伤组相比，壳寡糖组的甘油三醋(TG)和总胆固醇(TC)含量平均降低了50%和24% ，较好地保护了肝组织的损伤。申杰等在壳寡糖对高脂血症小鼠降血脂及肝脏保护的作用研究中发现壳寡糖可以显著提高蛋白结合巯基(PBSH)含量，降低MDA的含量，表明壳寡糖能显著抑制因高血脂造成的脂质过氧化物大量堆积对肝脏的氧化损伤，降低了脂质过氧化水平，并且保护了许多酶的活性不受抑制。【23】 以上几点就是壳寡糖主要的几个生物活性。此外壳寡糖在诱导植物抗逆防御反应方面也有良好的作用，并且在农业生产中已经开始了广泛的运用。同时通过对壳寡糖的衍生物的研究为壳寡糖增加了新的生物活性，进一步扩大了其应用范围。四、壳寡糖的应用现状4.1 在生物医药领域中的应用壳寡糖在医药领域方面的应用很广泛，如在抑制癌细胞、降低血糖、增强骨骼强度、促生长等方面。目前的研究表明，壳寡糖对多种肿瘤细胞，如肝癌细胞Bel-7402、Lewis肺癌细胞、Hela宫颈癌细胞系、人白血病K562细胞株等多种癌细胞都具有抑制效果。【5】由于壳寡糖具有一定的清除自由基的能力，使得壳寡糖具有降低糖尿病患者的血脂和提高机体的抗氧化能力。通过对成骨细胞中碱性磷酸酶基因表达的研究中发现，壳寡糖具有抑制破骨细胞，增强成骨细胞活性的作用，从而使得其具有促进骨折愈合、预防骨密度降低的作用。壳寡糖分子中的游离氨基是一种带正电荷的离子化合物， 能够促进肠道内双歧杆菌增殖，抑制有害菌的作用。4.2 在保健领域中的应用壳寡糖作为自然界中唯一的碱性多糖，生物活性高、无毒、无副作用， 可被机体快速的吸收，在日、韩、美、法、俄等国家都已开发成了保健食品。作为保健食品，可以激活动物的免疫系统，增强机体的免疫水平；由于具有清除血液中胆固醇的作用和降低血液中转氨酶的升高，因此有利于降低血脂和预防酒精肝的作用；能有有效地、选择性地吸附溶液中的重金属离子（如Cu2+、Cd2+、Zn2+、Ni2+、Ag+、Hg2+、Bi3+、Pb2+）；接早故壳寡糖在mRNA水平上有 调节造骨细胞的功能；能促进肠道内双歧杆菌的生长，调节胃肠道微生态平衡；低聚壳寡糖及其脂肪酸络盐在体内可与相当于他们许多倍重量的脂类物质等成不被消化吸收的络合物，从而促使脂类物质的排出，达到减肥瘦身的目的。4.3 在农林牧副渔领域中的应用壳寡糖生物农药在环境中易分解、无残留，无毒害、不污染环境、兼有药效和肥效的双重生物调节功能的特点，可诱导激活植物免疫系统，提高植物抗病毒能力，对农产品的品质和产量有明显的作用。畜牧养殖业由于药物饲料添加剂造成的生态危害，已经日趋严重，而壳寡糖作为新型饲料添加剂由于其无毒、无残留等热性，可以替代部分抗生素的使用，已经被广泛应用于多种畜牧业实际生产中。对于病害的严重性和低等无脊椎动物的免疫机制，壳寡糖免疫增强剂已经在水产动物中得到应用。除了在以上三方面的，可壳寡糖在精细化工领域中，可以作为化妆品的材料之一，起到保湿、抑菌、皮肤护理剂、毛发加工保护剂和防晒剂等的作用；在保鲜方面，以壳寡糖为主要成分，复配其他具有防腐、抗氧化作用的天然物质制备而成的天然生物防腐剂，可应用于食品中，具有防腐、增稠抗氧化等综合作用。五、壳寡糖在畜牧养殖业方面的主要运用成果随着2012年推出新版的饲料添加剂及其使用规范，国家在食品安全、饲料安全方面的要求越来越严格。而近年来，由于养殖结构的不断调整，规模化养殖迅速发展，集约化、集团化养殖日趋明显。但规模化发展的同时却带来了诸多的问题，高热病，口蹄疫、禽流感等烈性传染病不断地席卷全国各地，给养殖业带来了巨大的损失，而抗生素的超剂量添加使得养殖环境更为恶化。究其原因，归根结底，免疫抑制性疾病是罪魁祸首。那么安全、有效的提高机体的免疫水平，改善畜禽的健康状况就摆在了首要的位置。因此，行业内急需一种既能在饲料里添加，又能提高动物机体免疫力，安全、高效、绿色的新型饲料添加剂，而壳寡糖作为绿色、无害、无残、高效的新型饲料添加剂就应运而生，符合时代的需求。5.1 壳寡糖在生猪健康养殖上的应用壳寡糖在生猪养殖方面，主要运用在改善免疫力、促生长、提高繁殖性能等方面，同时在改善猪的均匀度、治疗僵猪、改善母猪便秘、提高药效等相关方面都有相应的研究。Tang等（2005）发现壳寡糖可以诱导仔猪中IL-1、IL-2、IL-6转录水平的提高。Liu等（2010）的研究证明，壳寡糖可以有效的阻止E. coli引起的仔猪发病，提高仔猪的免疫力，促进仔猪的生长。王秀武等（2005）的研究证明，日粮中添加了壳寡糖的仔猪的死亡率、次品率均显著降低，而平均体重显著提高。Tang等（2005）通过给仔猪喂食0.025%的壳寡糖发现，壳寡糖可通过增加生长激素（GH）和胰岛素样生长因子（IGF-）的表达，来促进仔猪的生长。Chae等（2008）发现，给仔猪喂食含壳寡糖的饲料可以减少猪肉中的胆固醇（16.4%）和油酸（28.3%）含量，提高猪肉的质量。Liu等（2008）研究表明壳寡糖可以通过调节肠道菌落平衡来促进仔猪的生长。在深圳某知名专业生产乳猪教槽料公司，在收集了近两年的使用时间里的数据显示，在母猪的整个繁殖周期和断奶前仔猪添加壳寡糖30ppm，断奶瘦母猪比例下降了26.4%，母猪间情期缩短了2.1天，每头母猪平均多产活仔数1-2头，仔猪初生均重增加了80克，平均活仔数增加了8.6%，窝断奶数和断奶均重分别增加了16.5%和10.8%，弱仔数和死胎数均下降了4.6%。在某权威科研机构，母猪怀孕后期、仔猪教槽和保育阶段添加壳寡糖30ppm，仔猪断奶窝重增加了16.67%，保育结束时仔猪均重增加了14.15%，保育期日增重增加了9.74%，保育期日采食量增加了12.48%，保育期料肉比降低了3.38%。在辽宁开原、葫芦岛等地的实际应用也显示，壳寡糖对促进肥猪生长，提高母猪受孕率有很好的效果。此外，在短期（7-15天）、高剂量饲喂壳寡糖给妊娠母猪，发现对改善母猪便秘的问题有一定的效果；在改善乳猪均匀度、治疗僵猪、降低仔猪死淘率方面都观察到了良好的效果。因此壳寡糖在生猪健康养殖方面的应用，因不仅仅只在于提高增重效果、改善免疫水平、改善繁殖性能等方面，还应该扩展至影响生猪健康及生产性能水平其他因素方面的应用，为进一步加快壳寡糖的应用推广提供更广阔的空间。5.2壳寡糖在肉、蛋鸡健康养殖上的应用壳寡糖在改善蛋品质、提高肉鸡产肉能力、降低死淘率、提高种鸡的繁殖力都有着良好的作用。李晓晶等（2007）用壳寡糖替代常用抗生素金霉素添加到肉鸡日粮中发现，壳寡糖组增重更明显，平均日增重等相关数据更佳。王秀武等（2003）在肉仔鸡日粮添加0.1%壳寡糖，结果表明，壳寡糖组盲肠内容物中大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的数量均呈下降趋势；回肠微绒毛密度增加（P0.05）；胸腺和法氏囊相对重量增加（P0.05），血清新城疫抗体效价提高（P0.05）；增重和料肉比得到明显改善（P0.05）。据此说明壳寡糖可以抑制肉仔鸡肠道菌，促进微绒毛生长发育，提高免疫能力和生产性能。Huang等（2006）运用分子生物学的方法发现添加壳寡糖后，肉鸡的免疫指标IgG、IgA和IgM均有大幅度的提高。2009年中科院沈阳生态所农产品安全与环境质量检测中心研究发现，饲料中添加了壳寡糖后鸡蛋的胆固醇含量明显下降。2010年在广东的实际应用显示，壳寡糖可以增加蛋壳厚度、密度，减少次品蛋的百分比，提高鸡蛋保存时间。2012年在天津的实际应用显示，壳寡糖在降低鸡群的死淘率、改善鸡群的肝肾肿大等方面有较为明显的作用。5.3壳寡糖在渔业健康养殖上的应用壳寡糖在渔业方面的应用最重要的是改善水产养殖动物的抗病能力，从而从一方面提高其生产性能。苏州市科技局（2004）用壳寡糖对青虾的成活率、亩产量、饵料系数进行试验，结果表明添加了壳寡糖后，青虾成活率提高了24.9%，亩产增加55.6%，饵料系数降低了4.2%。刘国兴等（2004）研究了壳寡糖对罗非鱼饲料利用率效果、肝脏脂肪代谢和肝组织抗超氧阴离子自由基、超氧化物歧化酶浓度的影响。结果表明壳寡糖能有效提高罗非鱼的体重和饲料利用率，提高罗非鱼肝组织内抗超氧阴离子自由基和超氧化物歧化酶的浓度，并且在一定浓度范围内的壳寡糖能有效促进罗非鱼的肝体比重和肝脂含量。Stale Refstie（1998）给大西洋鲑鱼分别喂食不含壳寡糖和含有壳寡糖的饵料55天，结果表明喂食含有壳寡糖的大西洋鲑鱼在增长率、饲料转换率以及蛋白质、脂肪消化率等方面均和对照组差异显著。蔡雪峰等（2006）研究了不同浓度壳寡糖对虹鳟幼鱼肠道菌群的影响以及利用壳寡糖作为唯一碳源的肠道细菌和虹鳟幼鱼抗嗜水气单胞菌感染的情况。结果显示，各组虹鳟幼鱼肠道优势菌有所变化。利用壳寡糖作为唯一碳源的菌株数量受到壳寡糖及其浓度的影响。壳寡糖能够提高虹鳟幼鱼抗啫水气单胞菌感染的能力。六、壳寡糖的应用前景近年来，环境污染和抗生素残留问题日益严重，人类健康越来越受到重视，许多国家先后做出限用或禁用化学合成药物做饲料添加剂的规定，我国也正在逐步的取消各种抗生素及化学合成类添加剂。壳寡糖作为新型饲料添加剂，因其安全无害，无残留，无抗药性，可以促进猪只生长及抗病的作用，日益受到人们重视，并广泛的应用于生产实践，为生产安全、放心、无污染的畜禽产品提供了可靠保证，壳寡糖产品必将愈来愈为人们所熟知，在未来的添加剂市场中必将占据极其重要的位置。【3】壳寡糖饲料添加剂寡糖素COSII是中国科学院大连化学物理研究所天然产物与糖工程（1805）课题组经十多年研究的成果。寡糖素COSII在山东、河南、广东、广西、四川、浙江、北京、辽宁等20 个省市应用，已得到了多家公司的认可，并且在一些大型饲料企业开始逐步运用开来。寡糖素COSII在调节动物机体的免疫力、增强消化道吸收功能、优化肠道微生物菌群、加快机体新陈代谢、促进畜禽快速生长等方面具有独特功效。壳寡糖作为新型饲料添加剂围绕饲料工业发展和食品安全的国计民生重大战略问题，进行多学科的交差与融合，解决海洋寡糖工程和糖生物学在畜禽生产中的重大技术和科学问题，为生产安全、放心、无污染的畜禽产品提供可靠的保证。壳寡糖新型绿色饲料添加剂高新技术尽快转化为生产力，加快推动国家产业技术发展的新政策，符合养殖户健康养殖的新理念，满足老百姓餐桌安全的新愿望，有利于促进我国绿色环保饲料产业和畜牧业健康养殖的形成.参考文献：【1】杜昱光，王克夷，白雪芳等. 壳寡糖的功能研究与应用. 北京.化学工业出版社. 2009.【2】王克夷. 糖生物学/方福德等分子生物学前沿技术. 北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1998:341-355.【3】胡志鹏. 壳寡糖的研究进展. 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