NMR在天然产物选择性.doc

沈阳化工大学研究生院2012级应用化学专业论文沈阳化工大学论文 NMR在结构解析中的应用进展 NMR在结构解析中的应用进展摘 要:核磁共振(NMR)是天然产物化学研究的重要手段.本工作将核磁共振技术作为选择性提取分离的监测手段,依据目标化合物的NMR谱学特征,以1H NMR监控和指导从植物体中寻找和得到二萜类化合物收到了较好的效果.并运用多种核磁共振技术对分离得到的3种二萜类化合物(jolkinolide A、jolkinolide B和17-hydro-xyjolkinolide B)进行了结构解析；此外，核磁共振波谱法在多糖结构分析中也有极大的用途。核磁共振波谱法(NMR)是解析物质结构最有效的手段，近年该技术的发展很迅速；再者，利用两种不同分离性能的高效液相色谱系统分别对我们生产的蔗果低聚糖浆产品与国外的同类产品进行了对照分析。结果表明,该糖桨中蔗果低聚糖的含量超过55%,主要由蔗果三糖(l一kestose)、蔗果四穗(nystose)和蔗果五糖(1,1,1kestopentaose)组成。从糖桨中分离纯化出的各低聚糖纯样的一维、二维碳氮核磁共振谱进一步确证了各糖成份的化学结构。由此证明,该糖浆产品的组成和各成份的含t均达到了国外同类(NeosugarG)的标准.这一研究将对该产品今后进入国内铸能性食品添加剂市场和生产质I监控具有重要指导意义。关键词:核磁共振(NMR);选择性分离;结构解析引言具有生物活性的先导化合物是创新药物的前提,也是影响创新药物周期的决定性因素1.核磁共振技术在天然产物化学研究中扮演着极其重要的角色,其提供信息丰富的优点,以及无破坏性与无偏向性的技术特点2完全可以满足在线监测的要求。近几年,更有科学工作者研究发现狼毒大戟中含有的二萜类化合物表现出了很强的抗癌活性3.本工作的主要目的是从狼毒大戟中选择性地分离提取二萜类化合物.其中以1H NMR技术作为主要手段,对选择性提取分离过程进行适时监测,并以谱学信息为依据对样品进行追踪筛选,收到了较好的效果；此外，核磁共振波谱法在多糖结构分析中也有极大的用途。多糖功能复杂，作为无细胞毒性的免疫促进剂，已发展成为一种免疫方法。另外，在肿瘤、,血管、肝炎、糖尿病、甚至艾滋病等疾病方面显示出特殊的效果，有些已在临床上广泛应用。结构是多糖活性的基础，多糖一级结构的研究包括单糖残基的种类和顺序，多糖残基在糖苷键中的位置，环状结构的类型和糖苷键的构型；再者，利用两种不同分离性能的高效液相色谱系统分别对我们生产的蔗果低聚糖浆产品与国外的同类产品进行了对照分析。结果表明,该糖桨中蔗果低聚糖的含量超过55%,主要由蔗果三糖、蔗果四穗和蔗果五组成。从糖桨中分离纯化出的各低聚糖纯样的一维、二维碳氮核磁共振谱进一步确证了各糖成份的化学结构。由此证明,该糖浆产品的组成和各成份的含量均已经达到了国外同类产品(NeosugarG)的标准.这一研究将对该产品今后进入国内铸能性食品添加剂市场和生产质监控具有重要指导意义。现将近年来核磁共振波谱在结构分析中的应用进展作一综述。一、NMR在天然产物选择性分离与结构研究中的应用1.1 谱学特征分析核磁共振作为监测手段必须能够适时地为选择性分离提供准确的反馈信息,自然对谱图信号的正确识别和解读非常重要;因而需要对目标化合物骨架结构的1H NMR谱学特征预先有所了解.二萜类化合物是指一类含有20个碳原子的化合物,其骨架结构的类型较多,核磁共振的谱学特征差异很大4.此外,该类化合物之间的差异主要体现在C环的变化上,但各种变化后的质子共振谱线都会带有原骨架结构的痕迹5.1.2 NMR结构解析考虑到3个化合物是同系列化合物,本工作采用了多种一维、二维实验技术对其中的一个样品(Y-3)进行相对完整的解析6,而其它2个样品则在此基础上设计和组织核磁共振实验7.1.2.1.Y-3相对空间构型的确认NOESY实验可以提供化合物空间结构的信息,然而由于该样品在高场区的信号较为密集,谱图解析难度较大8.H11和H20与H5和H7b间未观测到NOE信号,而与处于结构另一侧的H1b存在着NOE现象,表明这两个质子与H1b同侧9. H14与H7a间的NMR信号可以用来确定14位质子的相对空间位置10.有趣的是在COSY谱图上观测到了H9与H14和20的弱相关信号,根据谱学折线构型(H9与H14间、H9与H20间)的理论11可以对上述现象做出合理解释;这也为空间构型的确定提供了依据.1.2.2.Y-1与Y-2的结构分析比较Y-2与Y-3的1H NMR谱不难发现,二者间具有很高的相似度.其差异主要表现在Y-2谱中少了伯醇的相关信号,多了一组接双键甲基质子共振谱线(DH2.08).结果表明Y-1同Y-2比较只是11位与12位间的三元氧环被双键取代,并由此引起其它质子化学位移变化.另外,这里采用APT实验获取碳谱,由于该谱图上可以给出部分碳类型的信息,因而更有助于碳谱信号的指认.参照Y-3碳的归属数据,对APT进行分析后顺利完成了Y-1(jolkinolide A)和Y-2(jolkinolide B)的结构确证.二、NMR谱在多糖结构研究中的应用1.11H NMR谱对于多糖分子来说，由于不同糖残基中非异头质子的亚甲基和次甲基的化学位移非常靠近，结果它的 H NMR谱峰严重重叠，大部分质子共振峰出现在3040的非常小的区域内，给解析带来困难12。异头质子的信号对多糖结构的解析具有重要意义：一方面，其信号的线宽和积分可用于区别糖单元的类型及其相对含量；另一方面，也是最重要的一方面，可根据其化学位移和偶合常数的数值大小，来确定多糖结构中糖苷键的构型。1HNMR中异头质子与邻位质子的J为3 Hz，表明其葡萄糖残基均为构型13。解析图谱时一般先找出容易辨认的质子信号，如异头质子，再通过相同偶合常数的信号来确定其邻位质子14。1.2二维核磁共振(2D-NMR)1971年Jeener首先提出二维NMR谱方法15；1976年Ernst确立了2DNMR的理论基础并通过实验加以证明，其后Ernst和Freeman等又为2DNMR的发展和应用进行了深入的研究，迅速发展了多种二维方法并把它们应用到物理化学和生物学的研究中16通常，测定糖类样品一维1HNMR和13CNMR谱可得到其整体结构信息，二维NMR谱，如同核化学位移相关谱、 H检测的异核多量子相干相关谱、 H检测到的异核多键相干相关谱能给出相关碳氢连接方式方面的信息17,18。1.21 COSY(化学位移相关谱)COSY能够提供糖环中相邻氢核之问的耦合关系。COSY谱中，每个交叉峰反映了相邻氢核之间的耦合关系。交叉峰的强度与其有关的。3J 值密切相关，3J 值大，交叉峰的强度就大，反之亦然。122 COSY-45(一COSY). COSY的脉冲序列由两个90的脉冲组成。如果减小第二个脉冲的宽度，使其倾倒角减小，则会对交叉峰及对角线峰的精细结构产生影响。在COSY-45中，第二个脉冲角度是45。与COSY相比，COSY-45减少了平行跃迁问的磁化转移强度，限制了多重峰的问接跃迁19，对角线峰则因自身的自相关峰消失而简化20。因此，COSY-45谱中的对角线峰沿对角线变窄，减少了对邻近的交叉峰的干扰，有利于复杂分子的密集峰群的解析21。123HMBC(异核多键相关)HMBC把 1H核与长程耦合的13C核关联起来2223，其作用相应于长程H，CCOSY，它能提供分子骨架的结构信息24。对于多糖，HMBC可作为一种序列分析的工具给出糖单元间的连接次序。由此可见，HMBC在多糖结构研究中是一个非常有用的工具，它解决了糖残基连接序列的问题，这是以前的分析手段(包括lD NMR)难以做到的，这也正是2D NMR的魅力所在25。从Proteus vulgaris 045中得到一个多糖，通过HSQC与HMBC实验，结合其它二维谱，确认了组成多糖的各个单糖的自旋系统26 。三、蔗果低聚糖浆成分的高效液相色谱及核磁共振结构分析进展1.1蔗果低聚糖浆产品的成份和质最分析为了分析和确认产品的成分和质量,分别在两种不同分离特性的高效液相色谱系统,即HPAEC系统(系统A)和采用氨基柱结合ELSD检测器梯度洗脱的色谱系统(系统B),对我们的产品与NeosugarP标准品进行对照分析27。因为ELSD检测器不管对单糖、双糖、或者低聚糖(DP3),其出峰的面积都只与洗脱液中溶质的实际质量有关(即所谓的质量检测器)28。将Neosugar标准糖中各峰面积之和与样品糖浆各峰面积之和相比较,可以很容易地推算出糖浆样品中的总糖含量为76%29。本产品与国外商品的糖组成对照结果表明,我们的产品与日本、美国等市场上的明治寡糖糖浆(即NeosugarG)相似,NeosugarP标准品分析图谱中,也可以看到精制过的NeosugarP产品进一步分离除去了反应后混合糖浆中的葡萄糖和蔗糖30。这正是我们下一步要达到的目标。1.2蔗果低聚糖产品糖浆各组分的分离、纯化及核磁共振结构分析产品糖浆用水稀释(浓度控制在糖度约为40%,糖度计测),上P一2凝胶过滤色谱柱进行初步制备分离,蒸馏水洗脱,洗脱液流经示差折光检测器检测,收集合并GFZ、GF3、GF4各峰相应的洗脱液,减压浓缩各洗脱峰,再用制备性高效液相色谱仪对各峰进一步纯化(氨基柱,70%乙晴为洗脱液),收集蔗果低聚糖色谱纯组分,减压浓缩(温度60一7OC),浓缩液冻干得GFZ、GF3、GF4个白色粉状纯样31。低场部分(a90PPm)清楚的给倒峰,这说明这些碳原子都与偶数个氢原子出了各个低聚糖中的异头碳峰32.结论:GFZ、GF3、GF4样品分别具有l一kestose、nystose和1,1,1一kestopentose的结构3334。对1一kestose、nystose和1,l,l一kestopentose等蔗果低聚糖的生理,毒理实验,国外已进行了大量的研究、试验工作,美国食品与药物管理局(FDA)也已确认Neosugar为共认安全产品(GRAS)仁35。我们的产品也已经有关部门进行实验、检验,结果与国外文献报道的基本一致36。所以,确认了我们产品中低聚糖的主要成份及其结构,就为该产品的健康安全、市场准人问题提供了有说服力的根据,也为该产品工业化生产质量标准打下了良好的基础。4、 总结核磁共振是一种多方法和多参数的分析测试技术,这为NMR工作者提供了一个在实验方法选择和应用上的发挥空间.本文还针对天然化合物呈现系列化出现的特点,探讨了精炼实验内容,获取最有效信息的NMR结构研究的思路.本工作在实现了系列化合物的基本骨架的全NMR解析的基础上,合理地组织了包括APT、1D-TOCSY、1D-GOESY等具有编辑或选择特点实验方法,结合谱学比对完成了分离得到的3个同系列化合物的结构解析.这种选择不仅可以为结构解析提供可靠信息,也提高了谱仪使用的效率,达到了事半功倍的效果；再者，自从NNR技术被引进多糖的结构研究以来，它发挥着越来越重要的作用，现已成为多糖研究的常规手段。分子内H，H之间、C，C之间的化学环境比较相似，在NMR中的信号重叠严重，因此早期的NMR应用于多糖，所提供的信息很少，并未得到足够的重视，而多糖的结构分析主要依靠于化学分析法。近年，高磁场NMR仪的出现，使原来低磁场NMR仪上不能分辨的信号得以分开，尤其是2DNMR的快速发展，可以提供多糖结构中单糖残基的类型、各糖残基中C、H化学位移归属，各糖残基间的连接位置和连接顺序等诸多信息，甚至可提供某些多糖结构的全部信息，2DNMR在多糖结构研究中可以发挥重要的作用。因此，NMR技术在多糖中得到了广泛的应用，成为解析其结构不可缺少的工具。参考文献:1 Yu De-quan(于德泉). 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