芍药苷提取分离研究报告2.doc

【前言】芍药苷主要来源于毛茛科植物芍药根,牡丹根,紫牡丹根。关于芍药的使用，我国很早就有书面记载，始载于神农本草经，“主邪气腹痛，除血痹，破坚积，寒热疝瘕，止痛利小便，意气”。我国明间用于治疗胸腹腰肋疼痛，自汗盗汗，阴虚发热，月经不调，崩漏带下。现代研究表明其主要有效部位为芍药总苷，赤芍提取物含芍药甙(Paeoniflorin)、芍药内酯甙(Albiflorin)、氧化芍药甙(Oxypaeo- niflorin)、苯甲酰芍药甙(Benzoylpaeoniflorin)、芍药吉酮(Paeoniflorigenone)、芍药新甙(Lactiflor- in)、胡萝卜甙（Daucosterol），赤芍精（d-儿茶精，d-Catechin）及没食子鞣质（Gallotannin），苯甲酸（Benzoic acid），挥发油、脂肪油、树脂、糖、淀粉、黏液质、蛋白质等，主要成分为芍药苷，其具有镇静、解痉、抗炎、抗应激性溃疡病、扩张冠脉血管、对抗急性心肌缺血以及抑制血小板凝聚等多方面的作用，而且毒性小。临床上已试用于治疗冠心病，老年性疾病，增强体质与免疫功能、抗炎止咳、祛痰平喘等方面，尤其是老年慢性呼吸道疾病的治疗中可作辅助药物。 【理化性质】芍药苷（Paeoniflorin）又名芍药甙，化学名为：-D-Glucopyranoside,5,6-(benzoyloxy)methyl .tdtrahydro-5-hydroxy-2-methyl-2,5-methano-1H-3,4-dioxacyclobutacdpetalen-1a(2H)-yl,laR-(1a,2,3a,5a,5a,5b)- 分子式C23H28O11 ,分子量480.45 ，熔点 196 。本品为吸湿性无定形粉末，四醋酸酯为无色针状结晶，属蒎烷单萜苷，极性较大。药典记载，芍药苷遇香草醛会显现蓝紫色。本次试验的意义在于通过改进分离工艺来提高芍药苷的分离效果，以便应用于工业化大生产。【仪器试剂】材料：赤芍干燥根切片 500g。（由实验室提供）仪器：名 称规格 或 型号数量备 注圆底烧瓶500、1000、2000mL/24mm各1只球形冷凝管400mL/24mm21支烧杯100、1000mL各1只锥形瓶250、1000mL各1只铁架台1副带铁夹玻璃棒一根克氏蒸馏头24mm2一只尾接管24mm21支数字恒温水浴锅HH-2型4孔1台国华电器有限公司SHB-3循环水式真空泵、2孔1台郑州长城科工贸有限公司布式漏斗400mL1只旋转蒸发仪1台展开缸1个蒸发皿1个玻璃板5cm10cm25块三角瓶50mL20个层析柱8100cm1根钢盆1只胶头滴管1支吸耳球2个量筒10mL1支移液管0.50mL1支具支试管50mL1支钉子漏斗1个烘箱一台试剂名称规格厂家及批号用量乙酸乙酯CP天津市东丽区天大化学试剂厂 200802183000mL98%乙醇4000mL甲醇CP洛阳昊华化学试剂有限公司 060403500mL三氯甲烷CP天津市富宇精细化工有限公司 80423500mL活性炭CP350g硅胶GCP青岛海浪硅胶干燥剂厂310g有关芍药苷的提取常用水提、醇提以及超声三种方法。由于水提率不如醇提，而超声又会影响芍药苷结构的稳定性，所以采用醇提。分离采用活性炭吸附及硅胶柱层析。具体操作流程如下：【流程图】：赤芍粉末（500g） 70%乙醇回流3次，1h/次，合并提取液 过滤 药渣 滤液 减压浓缩(T60) 浓缩液 乙醇水溶液（回收） 1500ml水溶解 300g活性炭吸附 过滤 滤液 活性炭 水洗至无色（过滤） 活性炭 滤液 30%醇洗 醇水溶液 （回收） 活性炭 80%醇洗 直到TLC鉴定没有芍药苷 滤液 活性炭 减压浓缩（T60） 乙醇溶液（回收） 浸膏 硅胶柱层析（干法） 纯乙酸乙酯洗脱 洗脱液 减压浓缩至干 芍药苷【具体操作】醇水溶液回流提取 赤芍干燥根切片500g，用粉碎机粉碎成细粉。取250g加入2000mL圆底烧瓶中，分别以8倍、6倍、4倍量70%乙醇提取3次，每次提取 1h。每提取一次便浓缩一次，回收乙醇便可循环利用，合并3次的浓缩液。另一半药材以同样的方式处理，合并所有的浓缩液。活性炭吸附分离 取部分浓缩液稀释，加入活性炭吸附，过滤，将滤液和原液进行硅胶薄层点样，喷以显色剂，观察活性炭是否能将芍药苷吸附住，TLC鉴别如下：展开剂氯仿：乙酸乙酯：甲醇：甲酸 40：5：10：0.2（药典）。显色剂香草醛：甲醇：硫酸 5：80：15。配置方法：取0.1g香草醛，以10mL浓盐酸溶解，取其2.5mL溶液于显色喷瓶中，加甲醇40mL，再加浓硫酸7.5mL，摇匀即得。药典记载，芍药苷遇香草醛会显现蓝紫色斑点。右边为吸附后滤液点样点，左边为吸附前样液 样点 。箭头所指为蓝紫色斑点。由TLC鉴别可知，芍药苷可以被活性炭吸附。取9份2mL浓缩液，都稀释到10mL，加入等量的活性炭3g,分别以10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液洗脱，经TLC检测，40%及以上浓度的乙醇都能将芍药苷洗脱，而之前的都不能洗脱，部分点样如下: 从右至左分别为20%、30%、40%、50%乙醇溶液的洗脱液点样点。从上至下分别为蓝紫色斑点、浅黄色斑点、点样点。 由图可以判断芍药苷不能被30%及更低浓度的乙醇洗脱下来，但40%及以上浓度的乙醇都可以洗脱。 将所有浓缩液与以上检测液合并，加1500mL蒸馏水稀释，加入350g经105活化1h的活性炭吸附。搅拌，0.5h后过滤。滤液TLC检测没有发现蓝紫色斑点，说明芍药苷完全被活性炭所吸附。滤出的活性炭先以自来水洗至无色，再用80%乙醇溶液进行洗脱，直到洗脱液经TLC检测没有蓝紫色斑点为止，说明被吸附的芍药苷都被洗脱下来。将各次的洗脱液旋转蒸发浓缩，温度应小于60。 洗脱剂的选择 在进行硅胶柱层析之前应先选择合适的洗脱剂才能得到较纯的分离物，提高分离效率及节约成本。取3mL浓缩液稀释至10mL作点样液。 展开剂氯仿：甲醇 8：1 、分别为蓝紫色斑点、浅黄色斑点、点样点。可见芍药苷与另一种物质的Rf太接近，难以分离。 展开剂氯仿：甲醇 8：2 最右端为浓缩液，其余皆为稀释液。 、依次为浅红、蓝紫、棕黄、浅黄、点样点。 展开剂氯仿：甲醇 8：3 为蓝紫色斑点，但出现严重拖尾现象，作为洗脱剂是不可取的。 展开剂纯乙酸乙酯 最右端为浓缩液，其余皆为稀释液。 、分别为浅红、蓝紫色、点样斑点，与 氯仿-甲醇 8：2的展开系统相比，既使芍药苷与极 性更大的物质如多糖等分开又与极性小的物质如跑 在前面的红色斑点分开，所以选择纯乙酸 乙酯作为上柱洗脱剂比较合理。 硅胶柱层析分离 采用干法上柱。取110g旧硅胶G和200g新硅胶G于烘箱中105活化1.5h。用蒸发皿将浓缩液浓缩成浸膏，以适量98%乙醇溶解，与活化好的旧硅胶拌样，自然风干，再放到烘箱中80干燥2h。 取8100cm层析柱，检测不漏水，塞上脱脂棉，松紧适宜。先以新硅胶装柱，以吸耳球敲实整平，垫一张滤纸，再装干燥好的拌样旧硅胶，敲实整平，再垫一张滤纸。以玻璃棒引流加入纯乙酸乙酯，打开活塞，开到最大，使乙酸乙酯排尽柱中的空气，当有液滴流出时，旋转活塞调节流速2ml/min左右。用50mL三角瓶接取流份，30mL/份，TLC检测，用药典展开剂氯仿：乙酸乙酯：甲醇：甲酸 40：5：10：0.2。合并显色斑点相同的流份旋转蒸发浓缩。从第55流份开始，只有红色斑点，253nm荧光灯下观察无点；从第73流份，开始出现蓝紫色斑点，而80到90（第90流份借了200mL）流份没有任何斑点；从第91到183流份只有蓝紫色斑点，253nm荧光灯下观察无点，接收流份增至50mL/份；之后到186流份没有斑点，卸柱。将91至183流份分步旋转蒸发浓缩，将浓缩液收集与500mL输液瓶中。在收集过程中有白色粉末析出，部分粉末结块于瓶底，加热只有部分能溶解。加少量甲醇完全溶解，过滤，转置50mL锥形瓶中自然结晶，不成，冷冻干燥得干粉，称重3.1g。【鉴定】 TLC鉴定显蓝紫色斑点展开剂-氯仿：乙酸乙酯：甲醇：甲酸 40：5：10：0.2（药典）。显色剂香草醛：甲醇：硫酸 5：80：15。紫外检测再230nm处有最大吸收峰，为芍药苷特征吸收峰。高效液相测定 供试液制备 精密称定芍药总苷24mg，置经洗净的10mL容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，密塞，即得。 色谱条件 S_Gel C18 ,5um色谱柱；流动相：甲醇水（35：65）；柱温：室温；流速：1mL/min；检测波长230nm；进样量为20uL；tR=5.650.25min。对峰面积进行计算，其中230nm处主峰所占比例为87.37%，即芍药苷含量为87.37%。【结果】 经46天试验得到淡黄色芍药总苷冷冻干燥粉3.1g，经高效液相测定芍药苷含量为87.37%。 【讨论】 药材提取浓缩液出现沉淀问题 醇提水沉，赤芍粉末经醇提过滤浓缩，静置一夜后，棕色浓缩液中出现了褐色的沉淀，轻摇即散，没有将其过滤出来进行检测。 活性炭吸附洗脱问题 采用活性炭吸附时，一定要在水溶液中进行，在醇溶液中是不能吸附或吸附效果极差的。但实际操作中，没有将醇提液浓缩成浸膏再以水溶解，而只是将其浓缩至闻之没有乙醇的气味便加入了活性炭，能完全吸附含侥幸成分。洗脱时，一定要先用水洗至无色，洗掉色素及其他杂质，再用30%的乙醇洗掉部分杂质。但实际操作中，没有以水洗至完全无色，而且只用30%乙醇洗了一遍，以致残留 了许多杂质。 上柱后各接收流份处理及不能结晶问题 上柱后各物质相对被分开，极性小的物质最先被洗脱下来，出现杂质种类多含量少的现象，而且这些杂质在253nm荧光下都有斑点。但从第55流份到72流份只有红色斑点的物质，253nm荧光灯下观察无点，将其单独收集。但在最后的浓缩处理过程中，不颠将其掉入水浴锅。虽然进行了抢救，将水浴锅中的水引出，糖瓷盘中蒸发干，以甲醇溶解过滤，点样，红色斑点依旧在，但已不明显，放置一段时间后，容器壁上有水垢状物质结出，溶液点样已基本看不到红点，弃去。91到183流份只有蓝紫色斑点，253nm荧光灯下观察无点，应为芍药苷，将其单独收集，每500mL洗脱液浓缩一次，乙酸乙酯循环利用。采用旋转蒸发浓缩至有微粒混悬为止，用胶头滴管转置500mL输液瓶中，随着浓缩液的增多，在放置过程中析出的白色沉淀越来越多。水浴80加热，只有部分溶解，加入少量甲醇便完全溶解。旋转蒸发至干，甲醇溶解过滤，于50mL锥形瓶中结晶。随着甲醇的挥发，溶液越来越浓，但沉淀一直没有析出，液体的颜色也越来越深，由之前的浅黄向红色转变，有可能部分芍药苷已分解，因为芍药苷暴露于空气中或长期见光易被氧化分解使颜色加深，变成红棕色或红褐色。为减少损失，将甲醇蒸干，用少量蒸馏水溶解，转至蒸发皿中，液面高度不能超过1cm，于冰箱中冻结成冰，再进行冷冻干燥，得芍药总苷的冷冻干燥粉。 得不到结晶的原因分析 芍药苷在甲醇中溶解度过大；乙酸乙酯洗脱浓缩液有结晶析出时，没有及时的将其滤出，以致后来引入杂质增多难以结晶。个人推测：由试验可以看出芍药苷在乙酸乙酯中的溶解度并不大，但要使芍药苷能够结晶，必须先制成过稀溶液，再旋转蒸发浓缩至有混悬现象出现的过饱和溶液便可析出可滤出的成形沉淀。 收稿日期：2008-6-8 试验日期：2008-03-31至05-16【参考文献】 1 国家药典委员会. 中国药典, 部 S . 北京: 化学工业出版社,2000: 125. 2 马双成, 邓少伟. 赤芍总苷的生产工艺研究J. 中草药, 1998, 29(10):664-667. 3 潘浪胜 ,吕秀阳