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文档简介
鸿鹰祥生物工程有限公司实习报告实习目的:1、 我们学生不仅要学习好课本上的理论知识,更要将我们的理论应用于实践。实习就是培养我们的实践能力,用实践来检验我们的学习情况,发现我们的不足,完善我们的学习理论。同时实践是发现问题、研究问题、解决问题的重要手段。2、 让我们更好地了解生物工程产品工业化生产的全过程以及生产单位的组织管理、销售等方面的知识。3、 了解目前生物产业的发展状况、了解目前社会就业情况。确定自己的位子,为将来走向就业岗位做好思想准备和业务准备。实习要求:学生在实习中要做好各类报告、车间实习等各个环节的记录,学生应将每天的工作、观察研究的结果、收集的资料、所听报告内容等记入实习日记。实习日记是学生编写实习报告的主要资料依据,也是检查学生实习情况的一个重要方面和评定实习成绩的重要依据,学生每天必须认真填写,教师应随时检查实习日记。实习时间: 2011年4月12日至2011年4月22日实习安排: 分小组进行,本来要分四组的,由于中心化验室出了点小状况,改成三个组,我们成员:熊佳福(组长)、谢婧、陈畅、黄海波、瞿俊岚、王经纬。三个组分三个地方实习,三天一轮换,确保每个小组能到每个车间实习,同时每个都有人在实习,除了中心化验室除了点小状况,其他三个车间为:发酵车间、提取车间、车检化验室。轮换前天晚上每大组要开一次会,完成小组的交接工作,避免问一些重复简单问题,讲清楚每组要注意的问题,方便下一组的实习。 本组具体实习小河间安排: 4.134.15:提取车间 4.164.18:发酵车间 4.194.21:车间化验室 实习单位基本情况: 湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司是在原湖南津市酶制剂厂的基础上经改制建立的股份制企业。1978年开始从事酶制剂生产,为中国最早的一批酶制剂行业重点生产企业,2005年被评为湖南高新技术企业。公司占地面积4万平方米,配备现代化发酵设备800立方米和国际先进的超滤设备,年产酶制剂10万标吨。公司建有酶制剂研究所和顾客应用技术服务中心。主导产品有“梅花”牌糖化酶、中温淀粉酶、耐高温-淀粉酶、-淀粉酶等,产品畅销全国各地并远销欧美、日本、印度、东盟等世界多个国家和港、澳、台地区,除广泛应用与酿造、制药、制糖等传统工业外,现已大量用于燃料乙醇等可再生能源的工业生产领域,并以高纯度、高转化率的优秀品质享誉海内外。“酶花”牌糖化酶历届荣获省优产品称号。2001年,2004年连续两届被授予“湖南名牌”。 公司于2001年通过ISO9001:2000质量管理体系认证,ISO14001环境管理体系认证,KOSHER(犹太认证),严格按照质量管理体系组织生产、经营、并在此基础上逐步实施GMP管理。公司以“诚信经营、科技兴业”为企业宗旨,坚持“以规范的管理,保证质量标准;以最新的技术,促进品质提升;以周到的服务,赢得顾客满意”的质量方针,竭诚为广大客户提供高品质和高满意度的服务。公司产品介绍:(1)糖化酶(固、液两种) 作用:淀粉转化为葡萄糖 用途:酒精、淀 粉(2)耐高温淀粉酶(100110) 用途:应用于酒精、白酒、啤酒、味精、饴糖、葡萄糖等工业中液化淀粉和纺织业高温退浆。高温-淀粉酶具有极好的耐热性(3)中温淀粉酶(6080 ) 用途:纺织、印染(4)淀粉酶 生产工艺流程:蒸汽无菌蒸汽电力压滤盐析压滤加37-38的元明粉调配干燥灌装混粉入库包装入库加防腐剂:山梨酸钾和苯甲酸钠 非加碘食盐:调节比重,稳定pH中心化验室测酶活浓缩超滤絮凝绞条发 酵 车 间菌种原材料车间化验室硅藻土 钠基膨润土珍珠岩CaCl2 Na2HPO4 聚丙烯酰胺无水硫酸钠等绞条后固体颗粒粗,需干燥、粉碎如此重复2到3次下面我们再按车间的生产顺序来具体讲叙工厂生产的工艺流程以及要注意的一些事项:菌种的选育及培养:由于中心化验室除了点小状况,而菌种由位于中心化验室,对于他们的菌种不是很了解,仅知道是从国外进口的经基因工程改造后的高产酶,经过菌种经过菌种的复苏,菌种的筛选,获得生长旺盛,产酶量高的优良菌种进行扩大培养,主要为黑曲霉(糖化酶)和枯草芽孢杆菌(耐高温淀粉酶、中温淀粉酶)种子的扩大培养及发酵工艺和控制(发酵车间和车间化验室)该公司采用补料分批发酵方式发酵。所谓补料分批发酵是指半连续发酵或流加分批发酵,是指在分批发酵过程中,间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。其优点有:使发酵系统中维持很低的基质浓度;和连续发酵比、不需要严格的无菌条件;会产生菌种老化和变异等问题。不过其也有一些缺点:存在一定的非生产时间;和分批发酵比,中途要流加新鲜培养基,增加了染菌的危险。发酵车间有四种发酵罐,分为四级发酵。一、二、三级发酵为种子罐,菌种扩大培养在此进行,四级罐为发酵生产罐。由于有有氧发酵,因此还附有空气采集、净化和输送系统。另外还有锅炉蒸汽系统。 (一)发酵车间工艺流程清洗发酵罐灭菌冷却接种一级发酵罐二级发酵罐三级发酵罐四级发酵罐放罐(二)发酵原料 发酵原料有主要是玉米浆 玉米淀粉 豆粕和无机盐等。发酵原料先需在配料池按培养基配方配好再加中温淀粉酶液化一定时间,再经高温淀粉酶。液化的目的使淀粉转化为可发酵性糖,还可以节约成本提高原料的利用率,减少机器的损伤。(三)发酵设备发酵设备主要有:发酵罐和补料罐等。发酵罐的主要部件有:罐体:主要用来培养发酵各种菌体,密封性要好(防止菌体被污染);罐体当中有搅拌浆,用于发酵过程当中不停的搅拌;底部通气的Sparger,用来通入菌体生长所需要的空气或氧;罐体的顶盘上有控制传感器,最常用的有pH电极和DO电极,用来监测发酵过程中发酵液pH和DO的变化控制器,用来显示和控制发酵条件等等;发酵罐外部有两个钢化玻璃制作的视镜,一个上有照明灯,另一个是用来观察搅拌发酵中的情况;人梯:有工人师傅下罐查看发酵死角(藏污纳垢之所)的梯子;发动机:发酵罐的顶部有带动搅拌桨转动的动力装置(四)发酵灭菌空消:压强0.12Mpa 灭菌时间60min实效:压强:0.11-0.12Mpa;温度:121-123,灭菌时间:35-40min。(如果是空气比较潮湿的季节,由于物料容易霉变,因此灭菌时间要适当延长,一般为45min左右)(五)发酵接种种母摇瓶培养48h后,菌种生长处于对数生长期,开始接种。接种步骤如下:1、用纱布裹住酒精圈,倒上酒精;2、将酒精圈套在发酵罐的通料口上,再点燃酒精圈,在高处撑伞;3、将菌种瓶瓶口在火上预热1分钟左右,倒入含有菌种的培养液;4、关上通料口,取下酒精圈,熄火。(六)发酵参数及过程控制发酵条件控制主要指对温度、pH、罐压、通气量、泡沫和补料等的控制。一般的,一、二、三级种子罐每三十分钟检查温度一次,每六十分钟检查罐压、风量一次;发酵罐每三十分钟检查温度一次;每六十分钟检查罐压、风量一次;每六十分钟检查PH值一次。以糖化酶为例,说明参数如下:项目酶罐温()罐压(Mp)通气量(m/h)pHDE糖化酶340.3-0.9一级罐不通气二级罐80三级罐300四级罐400-9004.2-4.920-90以高淀生产为例说明种子罐控制:1、一级罐温度控制正常为37-39 任何时间主任检查,温度高于39或低于36是为违规操作;2、一级种子罐取样口必须跑蒸汽,取样后准确保样阀关紧;3、压力:每小时记录,罐压力控制在0.08-0.10Pa;4、PH的测定:测消后PH记录,在后46小时,测定PH值,但PH高于消后PH值,及时通知值班主任来处理。发酵过程参数的控制:1、温度控制温度对微生物的影响,不仅表现在对菌体表面的作用,而且因热平衡关系,热量传递到菌体内,对菌体内部的所有物质与结构都有作用。该公司采用的最适发酵罐的温度为34左右。发酵罐内的温度一般用蛇形管冷却系统来维持,温度过高则增大冷却水流量,温度过低则将热蒸汽通入蛇形管来升温。如果温度过高难以降下来,可以以自来水喷淋发酵罐来辅助降温。2、pH值控制pH对发酵的影响有:(1)发酵液的pH值的改变,使微生物细胞原生质膜的电荷发生改变。(2)发酵液的pH值直接影响酶的活性。(3)发酵液的pH值影响培养基某些重要营养物质和中间代谢产物的解离,从而影响微生物对这些物质的利用。(4)发酵液的pH值影响菌体的代谢过程。对于第一级种子罐的pH只进行监测,而不调控,因为其pH的变化是其发酵成熟的判断标准,当pH由4.8降到3.0时,一级发酵罐成熟。而其余的几级发酵罐的pH控制在4.8左右。由于黑曲霉的发酵过程是一个产酸的过程,因此随着发酵时间的延长,pH不断降低,这时需要用补充氨气来提高pH值。氨气的补充量即氨气的通人时间是由实践经验来确定的。氨气补充不能过量,过量后pH升高,容易杀死微生物。导致发酵失败。3、通气控制溶氧是需氧发酵控制最重要的参数之一。由于氧在水、发酵液的溶解度都很小,因此,需要不断的通气和搅拌,才能满足不同发酵过程对氧的需求。溶氧的大小对菌体生长和产物的形成都会产生不同的影响。4、泡沫控制泡沫是气体在液体中的粗分散体。属于气液非均相体系,在这个体系中,分散相是(气体),连续相(液体)。产生的原因有:(1)由外界引进的气流被机械地分散形成;(2)发酵过程中产生的气体聚结生成;气液接触:搅拌液体时混入气体;气体从液体内部产生;含助泡;起泡速度高于破泡速。泡沫对发酵的不利影响有:(1)降低发酵设备的利用率;(2)增加了菌群的非均一性;(3)增加了染菌的机会;(4)导致产物的损失。一般采用化学消泡法即在发酵液中加如食用油使泡沫破碎。 发酵罐内部构造 发酵记录数据 正在清洗发酵罐 (七)发酵期间产品检测车间化验室是检测发酵期间各级罐的酶活力及DE值的地方,根据DE值及酶活力值判断什么时候需要给级罐补料,什么时候放罐,是否染菌。但在车间化验室,对酶活力的测定没有中心化验室精确,但在方法上大致与中心化验室一致(高温淀粉酶和中温淀粉酶除外)。一级种子罐:8h 后测DE值,32h每4h测定DE值。二级种子罐:8 h后测DE值,32h每8h测DE值和酶活力。三级种子罐:8h后测值,每后测值与酶活力。大罐(四级罐):每测值与酶活力,补料后每测一次值。1、DE值的测定(1)DE值的定义:还原糖与糖浆干物质的百分比。国家标准中DE值越高,葡萄糖的级别越高,工业上用DE值(也称葡萄糖值)表示淀粉的水解程度或糖化程度 糖化液中还原性糖全部当作葡萄糖计算,占干物质的百分比称为DE值。(2)测定原理:用菲林试剂法测定发酵液中的每ml发酵液中葡萄糖的含量(3)取样:(4)试剂的配置: 菲林试剂(A液:称取69.3g纯硫酸铜并溶解于900 ml的蒸馏水中,并用蒸馏水定容至1000 ml;B液:称取346g酒石酸钾纳和100g氢氧化钠,用蒸馏水溶解并定容至1000 ml);30%的KI溶液;26%硫酸溶液;1%淀粉指示剂;0.1N 硫代硫酸钠溶液;1%的标准葡萄糖溶液 (5)测定步骤: 在三角瓶中加入适量的样品,吸取的体积要求控制消耗0.1N 硫代硫酸钠溶液在10ml-15ml之间;加水稀释至250ml;加入菲林试剂A、B液各10ml于三角瓶中;置电炉上加热至沸腾2min;取下冷却;加入30%KI 10ml;加入26%硫酸溶液; 加入1%的淀粉指示剂;用0.1N 硫代硫酸钠溶液滴定至兰色消失为终点;标准样品:在三角瓶中加入5ml 1%的标准葡萄糖溶液,然后加水20ml。 理论上:以水为空白时应消耗的0.1N 硫代硫酸钠溶液27.5ml,以5ml% 标准葡萄糖溶液为标准时,消耗每毫升0.1N 硫代硫酸钠溶液相当于50/27.5-12.5=3.33mg 葡萄糖/毫升(6)计算DE=(Vo-V1)/Vo-Vs*50/v mg/molV0:25ml空白液消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数VS:5ml1%的标准溶液消耗硫代硫酸钠的毫升数V1:表示样品消耗的硫代硫酸钠的毫升数2、酶活力车间的酶活力是发酵车间操作的参考数据之一,因此,在精确程度上不及中心化验室。糖化酶活力的测定与中淀和高淀的不同,中淀和高淀主要采取目测法,二者操作基本相同,只是酶反应温度不同,中淀是在600.1,高淀在700.1。(1)糖化酶酶活力测定 酶活力定义:1g酶粉/1ml酶液于400.2,pH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为1个活力单位,以u/g(u/ml)表示。 原理:糖化酶能从淀粉分子非还原性末端开始,分解-1, 4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基,能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,由此可计算酶活力。碘量法原理为在碱性介质(NaOH)中,碘歧化为次碘酸钠和碘化钠,次碘酸钠氧化溶液中游离的醛基为酸基。适当酸化,剩余的次碘酸钠与碘酸钠又生成碘,以淀粉为指示剂,用硫代硫酸钠标准溶液滴定。根据总碘量和硫代硫酸钠的用量,可对应获得甲醛的量。反应为:I2+2OH-=OI-+I-+H2O ; HCHO+OI-+OH-=HCOO-+I-+H2O;OI-+I-+2H+= I2+H2O; I2+2S2O32-=S4O62-+2I- 实验材料、溶液及试剂乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH=4.6),硫代硫酸钠标准溶液(0.05mol/L),碘溶液(0.1N),氢氧化钠溶液(两种:一种浓度为0.1mol/L,另一种浓度为20%),硫酸溶液(2N),2%可溶性淀粉溶液,10g/l淀粉指示剂、器材恒温水浴锅,滴定管架,碱式滴定管,秒表,比色管,碘量瓶,容量瓶等 步骤:、标样酶液的制备称取酶粉12g,精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00ml),先用少量的乙酸缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上清夜小心倾入容量瓶中。沉淀部分再加入少量缓冲液,如此捣研34次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在100250u/ml范围内),摇匀。通过4层纱布过滤,滤液供测定用。、测定在甲乙两支50ml比色管中,分别加入2%可溶行淀粉溶液25ml及pH4.6乙酸乙酸钠5ml,摇匀后,于400.2恒温水浴锅中预热5min。在甲管中加入待测酶液2ml立刻摇匀计时;在此温度下准确反应30min后,立即取出各加入20%氢氧化钠0.2ml,摇匀,冷却,并在乙管中补加待测酶液2ml。吸取上述反应液分别置于250ml碘量瓶中,准确加入0.1N碘溶液10ml,再加0.1mol/L氢氧化钠溶液15ml,摇匀,密塞,于暗处反应15min。取出,加入2mol/L硫酸溶液2ml,摇匀;立即用0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定蓝色刚好消失为其终点。 计算X(A-B)*C*90.05*(32.2/5)*(1/2)*n*2=579.9*(A-B)*C*nA-空白消耗硫代硫酸钠的体积(ml) B-样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积C-硫代硫酸钠标准溶液的浓度(mol/L)90.05-与1ml硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L)相当的以克表示的葡萄糖的质量32.2-反应的总体积(ml) 5-吸取反应液的体积(ml)1/2-吸取酶液2ml,换算成1ml n-稀释倍数2-反应30min,换算成1h的酶活力。(2)中淀(或高淀)酶活力测定 原理:a淀粉酶能将淀粉分子链中的a,葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精,少量麦芽糖和葡萄糖,而使淀粉对碘呈蓝色的特异反应消失而变成红棕色,其颜色消失的速度与酶活力有关,故可在标准条件下通过测定反应时间而算出酶活力。 实验试剂:原碘液;稀碘液;2%可溶性淀粉;缓冲液pH6.0;标准色终点溶液(A液:CoCl2.6H2O 0.2439g和K2Cr2O7 0.4878g用水定容至500mL;B液:称取鉻黑T40mg用水溶解定容至100mL);标准终点色:取A液40mL与B液5mL充分混匀备用。 实验步骤: 酶制备液 酶浓度300500u/mL; 吸取标准色溶液6mL于试管中,做比色标准; 吸取20mL12%淀粉溶液和pH6.0缓冲液5mL置于2020mL试管中,在700.1恒温水浴器中预热平衡5min,然后加入酶制备液0.5mL立即记录时间,摇匀,当反应接近2min时就开始不断用吸管取1mL反应液加至预先盛有稀碘液5mL的试管中,当试管中反应液的颜色由紫变为红棕色与标准点相同时,即为反应终止,记录时间t 酶反应时间2-2.5min 计算公式X=(1/t2020/1000n)0.5103t:反应到点的时间min;20:淀粉溶液的体积;2%:淀粉浓度;n:稀释倍数0.5:酶制备液的体积;1000:1g=103mg;样品质量3、测定的重要参数对于大罐,当DE值达到15以上(包括15)时,进行第一次补料,之后每小时加一次料;当DE值低于5一下时(包括5)时,放罐。对于种子罐活力达1.5万时导入大罐发酵。一般DE达到30左右开始产酶。(八)发酵时间:一级罐50小时;二级罐50小时;三级罐50小时;四级罐150180小时 车间化验室实验组图(九)空气系统1、空气净化工艺流程如下:高空采气空气压缩空气贮藏罐(作用:由于空气经过空气压缩机后,产生不稳定的气流波,利用空气贮藏罐可以使气流平稳)冷却(目的:空气经过压缩,升温的70-80,在突然降温,水分凝集,再用旋风分离器去除)旋风分离器(除油、水)丝网分离器(除灰尘)加热器(目的:气流经过丝网分离器后,经加热器升温到50左右,是空气的湿度降低,有助于过滤)总过滤器(棉花、膜)粗滤(0.3-0.5um)精滤(0.1-0.3um)入罐2、空气过滤器的操作要点:(1)空气过滤器始终保持干燥状态 (2)当过滤器用蒸气灭菌时,应先将蒸汽管和过滤器内部的冷凝水放掉,灭菌蒸汽的压力应保持在0.170.2MPa(表压)。 (3)小型过滤器的灭菌时间约为0.5h,蒸汽从上向下冲;大型过滤器的灭菌时间约为1h,蒸汽一般先从下向上冲0.5h,再从上向下冲0.5h。(4)过滤器灭菌后应立即引入空气,以便将介质层内部的水分吹出,但温度不宜过高,以免介质被烤焦或焚化。 (5)蒸汽压力和排气速度不宜过大,以避免过滤介质被冲翻而造成短路。(6)防止发酵罐中的发酵液会倒流到过滤器中来。产物提取与精制(一)总工艺流程图:发酵料液预处理罐加压罐皂 土(钠基膨润土)H2SO4稀释罐H2SO4贮罐自来水压缩空气硅 藻 土(或膨胀珍珠岩粉)一级板框压滤滤饼盐析饲料浑液罐清液贮罐硅藻土二级板框压滤预涂循环罐滤饼盐 析三级板框压滤清液贮罐超滤循环罐超 滤冷却器冷却水理化检测废 液超滤器残留酶回收罐 菌种室质检部调 配溶解桶山梨酸钾溶解苯甲酸钠成品精滤成品贮罐包 装入 库溶解桶Na2CO3滤饼盐析预涂循环罐硅藻土理化检测菌种室质检部灭菌二次利用塑料桶无菌塑料桶(袋)(二)基本操作步骤 目的方法所加原料絮凝 分开固液相 降低黏度 防止细菌生长及杂酶载体吸附、稀释a控制能源b调节PHc加防腐剂d加吸附剂珍珠岩、水、控制还原糖、硫酸、甲苯酸钠、山梨酸钾、皂土(纳基膨润土)一级压滤分离固液相压滤二级压滤 进一步分离杂质 进一步分离杂菌压滤压滤超滤浓缩彻底浓缩调配 防止成品变质 调节酶活力加防腐剂调节PH苯甲酸钠、山梨酸钾、碳酸钠精滤彻底除菌压滤(三)具体步骤及原理1、絮凝料液预处理工艺预处理的目的:通过添加某些物质,调节pH等方法来改变发酵液的性质,有助于目标产物的释放及后阶段的提取分离。预处理还能加快固液分离速度,提高分离效率。添加的物质有硅藻土(或膨胀珍珠岩粉)、皂土(钠基膨润土)。硅藻土是百年前水生植物沉淀下来的遗骸,珍珠岩是处理过的膨胀火山岩。由于硅藻土和珍珠岩具有质地坚硬,不可压缩的粒状物质性质,所以其能增加滤饼强度,使其具有格子型结构从而增加滤饼的通透性,使滤孔不易堵塞,提高过滤能力。此外它还能截留悬浮液中的细小粒状胶态物质,改善滤液澄清度。皂土(钠基膨润土)具有吸附小分子代谢产物的作用,有利于产物的提纯。pH值通过添加稀硫酸水来调节。放罐后的发酵液的pH值为4.8左右,通过加入pH值为1.5的稀硫酸溶液,将其pH调至3.0,有助于细胞凝集,便于过滤。以中淀和高淀为例,见下表项目酶pH氯化钙磷酸氢二钠聚丙烯酰胺高淀8.5-8.7740.1中淀7.230.70.32、一级压滤发酵液放罐后,经压缩空气压入絮凝罐,加入硅藻土(或珍珠岩粉),加入pH为1.5-1.8的硫酸水,将混合液调制pH为3.0,然后用压缩空气压入第一级板框压滤机,进行的一次压滤。由于刚开始压滤时没有形成滤饼,滤液较浑浊,因此将浑浊滤液放入浑液罐,再用泵将其泵回一级压滤,直至滤液澄清,将滤液放入清夜罐。3、二级压滤将清夜罐中的滤液放入预涂罐,加入硅藻土(或珍珠岩粉)助滤。4、超滤根据客户需求,经中心化验室检测的酶活力,确定超滤时间。超滤进出料压不超过1.5千克,温度控制在30摄氏度左右。5、调配根据产品规格要求,对酶活力高出范围的加水(液体)或元饼粉(固体),加入防腐剂苯甲酸钠和山甲酸钠,并调节PH。6、精滤打开紫外灯对精滤车间进行消毒处理,对滤布用稀碱液进行处理。精滤后由中心化验室对细菌总数进行检测,必须达到公司标准。卫生标准如下:项目参数重金属(以铅计(mg/kg)30铅(mg/kg)5砷(mg/kg)3菌落总数(CFU/ml)5010大肠杆菌(MPN/100ml) 310沙门氏菌不得检出致泻大肠埃氏菌不得检出7、成品灌装成品桶用酒精消毒,灌装秤量必须准确,外观洁净,每批次保留原样一瓶,以便随时检测观察。(四)液酶浓缩操作规则1、接到放灌通知,应对相应管道、设备进行消毒清洗、并检查高位桶底阀 2、准备测量体积、PH、按工艺配方添加助滤剂。3、认真安装压滤板滤布,并用碱溶液PH 11-12进行消毒处理。4、滤涂要均匀,确认无漏料现象,在进料,前一吨料必须清澈后才能进清 夜池。5、二次过滤时,必须清澈,并用试管进行观察,过滤力起3Kg时必须更换滤 布。6、
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