核酸探针技术.pdf

核酸探针技术核酸探针技术 化学及生物学意义上的探针 probe 是指与特定的靶分子发生特异性相互作 用 并可被特殊的方法探知的分子 抗体 抗原 生物素 抗生物素蛋白 生长因 子 受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用 核酸探针技术原理是碱基配对 互补的两条核酸单链通过退火形成双链 这一过 程称为核酸杂交 核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段 它能和与其 互补的核酸序列杂交 形成双链 所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检 测 每一种病原体都具有独特的核酸片段 通过分离和标记这些片段就可制备出 探针 用于疾病的诊断等研究 一 核酸探针的种类 1 按来源及性质划分 可将核酸探针分为基因组 DNA 探针 cDNA 探针 RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类 作为诊断试剂 较常使用的是基因组 DNA 探针和 cDNA 探针 其中 前者应用 最为广泛 它的制备可通过酶切或聚合酶链反应 PCR 从基因组中获得特异的 DNA 后将其克隆到质粒或噬菌体载体中 随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获 得大量高纯度的 DNA 探针 将 RNA 进行反转录 所获得的产物即为 cDNA cDNA 探针适用于 RNA 病毒的检测 cDNA 探针序列也可克隆到质粒或噬菌体 中 以便大量制备 将信息 RNA mRNA 标记也可作为核酸分子杂交的探针 但由于来源极不方便 且 RNA 极易被环境中大量存在的核酸酶所降解 操作不便 因此应用较少 用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛 可根据需要随心 所欲合成相应的序列 可合成仅有几十个 bp 的探针序列 对于检测点突变和小 段碱基的缺失或插入尤为适用 2 按标记物划分 有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类 放射性标记探 针用放射性同位素做为标记物 放射性同位素是最早使用 也是目前应用最广泛 的探针标记物 常用的同位素有 32P 3H 35S 其中 以 32P 应用最普遍 放 射性标记的优点是灵敏度高 可以检测到 Pg 级 缺点是易造成放射性污染 同 位素半衰期短 不稳定 成本高等 因此 放射性标记的探针不能实现商品化 目前 许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针 目前应用较多的非放射性标记物是生物素 Biotin 和地高辛 digoxigenin 二者都 是半抗原 生物素是一种小分子水溶性维生素 对亲和素有独特的亲和力 两者 能形成稳定的复合物 通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质 如酶 荧光素等 进行检测 地高辛是一种类固醇半抗原分子 可利用其抗体进行免疫 检测 原理类似于生物素的检测 地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 同位素标记的相当 而特异性优于生物素标记 其应用日趋广泛 二 核酸探针的标记 1 放射性同位素标记法 常将放射性同位素如 32 P 连接到某种脱氧核糖核苷三 磷酸 dNTP 上做为标记物 然后通过切口平移法标记探针 切口平移法 nick translation 是利用大肠杆菌 DNA 聚合酶 I E coli DNA polymerase I 的多种酶促活性将标记的 dNTP 掺入到新形成的 DNA 链中去 形 成均匀标记的高比活 DNA 探针 其操作方法如下 1 取 1 g DNA 溶于少量无菌双蒸水中 加入 5 l 距离大约 10 切口平移缓冲液 0 5mol L Tris HCl PH7 2 0 1 mol L MgSO4 1mmol L 二硫苏糖醇 500 g mL 牛血清白蛋白 加入除标记物 如 32 p dATP 外的其它三种 dNTP 如 dCTP dGTP dTTP 溶液 20mmol L 溶液各 1 l 2 加入 100 ci 10 l 标记物溶液 加入无菌双蒸水至终体积为 46 5 l 混匀 加入 0 5 l 稀释的 DNaseI 溶液 混匀 加入 1 l 约 5 单位 E coli DNA polymerase I 混 匀 3 置 14 16 反应 1 2 小时 2 非放射性标记法 可将生物素 地高辛连接在 dNTP 上 然后象放射性标记一 样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针 也可让生物素 地高辛等直接与 核酸进行化学反应而连接上核酸链 其中 生物素的光化学标记法较为常用 其 原理是利用能被可见光激活的生物素衍生物 光敏生物素 photobiotin 光敏生物 素与核酸探针混合后 在强的可见光照射下 可与核酸共价相连 形成生物素标 记的核酸探针 可适用于单 双链 DNA 及 RNA 的标记 探针可在 20 下保存 8 10 个月以上 具体操作方法如下 1 将双链 DNA 变性或用 NaOH 处理形成缺口 单链 DNA 或 RNA 毋需处理 将核酸样品溶于水 2 暗室下在微量离心管中加入10 g DNA 1mg ml光敏生物素20 l 加水至50 l 混匀 3 冰浴中打开离心管盖 在 300 500 瓦灯下照射 10 分钟 液面距灯泡 10cm 4 加入 100 l 0 1mol L Tris HCl pH8 0 加入 100 l 2 丁醇抽提两次 离心 弃上层 5 乙醇沉淀核酸探针 用 70 乙醇漂洗真空抽干 备用 除上述标记法外 探针的制备和标记还可通过 PCR 反应直接完成 三 核酸杂交 杂交技术有固相杂交和液相杂交之分 固相杂交技术目前较为 常用 先将待测核酸结合到一定的固相支持物上 再与液相中的标记探针进行杂 交 固相支持物常用硝酸纤维素膜 nitrocellulose filter membrane 简称 NC 膜 或 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 尼龙膜 nylon membrane 固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交 前者包括三个基本过程 第一 通过印 迹技术将核酸片段转移到固相支持物上 第二 用标记探针与支持物上的核酸片 段进行杂交 第三 杂交信号的检测 用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交 某特点是靶分子固定在细胞中 细胞固定在载玻片上 以固定的细胞代替纯化的 核酸 然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里 探针进入组织细胞与靶分子杂交 而靶分子仍固定在细胞内 例如 可用特异性的细菌 病毒的核酸做为探针对组 织 细胞进行原位杂交 以确定有无该病原体的感染等 原位杂交不需从组织中 提取核酸 对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性 在临床应用上有独特 的意义 近年来液相杂交技术有所发展 液相杂交与固相杂交的主要区别是不用纯化或固 定的靶分子 探针与靶序列直接在溶液里作用 液相杂交步骤有所简化 杂交速 度有所提高 增加了特异性和敏感性 但与临床诊断所要求的特异性和敏感性还 有一定的距离 各种杂交技术中 膜上印迹杂交技术应用最为广泛 它由以下三个基本过程组成 1 核酸印迹技术 1 斑点印迹 Dot blot 将待测核酸样品变性后直接点样在膜上 称之为斑点印 迹 为使核酸牢固结合在膜上 通常还将点样后的膜进行 80 真空烘烤 2h 应用斑点印迹技术 可在一张膜上同时进行多个样品的检测 操作简便 快速 在临床诊断中应用较广 适合进行特定基因的定性及定量研究 但不能鉴定所测 基因的分子量 2 Southern 印迹 Southern blot 这是指将 DNA 片段经琼脂糖凝胶电泳分离后 转移到固相支持物上的过程 常规处理如下 先用限制性内切酶对 DNA 样品进行酶切处理 经琼脂糖凝胶电 泳将所得 DNA 片段按分子量大小分离 接着对凝胶进行变性处理 使双链 DNA 解离成单链 并将其转移到 NC 膜或其它固相支持物上 转移后各 DNA 片段的 相对位置保持不变 用探针与经 Southern 印迹处理的 DNA 样品杂交 可鉴定待 测 DNA 的大小 进行克隆基因的酶切图谱分析 基因组基因的定性及定量分析 基因突变分析及限制性片段长度多态性分析 RFLP 等 Southern 印迹的操作方法有三种 毛细管转移 或虹吸印迹 这是一传统方法 进行毛细管转移时 DNA 片段 由液流携带从凝胶转移到固相支持物表面 安放装置时 在转移槽中央的平台上 由下到上依次叠放变性凝胶 滤膜 一叠干的吸水纸巾 凝胶与转移缓冲液通过 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 一纸桥连接 滤膜上的纸巾吸水而产生并维持毛细管作用 液体由于毛细管作用 抽吸通过凝胶 并将 DNA 片段携带聚集在滤膜上 DNA 片段的大小和琼脂的浓 度决定了转移的速度 小片段 DNA 1kb 在 1 小时内可从 0 7 琼脂糖凝胶上 几乎定量转移 而大片段 DNA 的转移较慢且效率较低 如大于 15kb 的 DNA 片 段需要 18 小时而转移尚不完全 电转移 利用电场的电泳作用将凝胶中的 DNA 转移到固相支持物上 可达 到简单 迅速 高效的目的 一般 2 3 小时内可转移完毕 电转法不宜采用 NC 膜 因为 NC 膜结合 DNA 依赖高盐溶液 而高盐溶液在电泳过程中会破坏缓冲 体系 使 DNA 损伤 一般使用化学活化膜和正电荷修饰的尼龙膜 此外 电转 过程中转移体系的温度升高 必须使用循环冷却水 商业化的电转仪一般附有冷 却设备 也可在冷室中进行 具体操作时 按仪器使用说明安装电转装置 将变 性凝胶夹在转移膜内平行电极内侧的多孔板之间 排除夹层间气泡 加入转移缓 冲液并通电进行电转 真空印迹法 这是近年来发展起来的一种简单 快速 高效的 DNA 和 RNA 印迹法 其基本原理是利用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层的容器抽到下层 凝胶中的核酸片段将随缓冲液移置到凝胶下面的固相支持物上 这一方法的最大 优点是快速高效 可在转膜的同时进行 DNA 的变性与中和 30 分钟至 1 小时可 完成 适合检疫工作的要求 已有商业化的真空转移仪提供 可按商品使用说明 进行操作 Southern 印迹后的滤膜仍需进行固定处理 对 NC 膜可用 80 真空烘烤 2 小时 对尼龙膜还可用短波紫外线 波长 254nm 照射几分钟 3 Northern印迹 Northern blot Northern印迹是指将RNA片段变性及电泳分离 后 转移到固相支持物上的过程 RNA 样品经 Northern 印迹后进行杂交反应可 鉴定其中特异 mRNA 分子的量与大小 Northern 印迹的方法与 Southern 印迹基本相同 可参照进行 但 RNA 的变性方 法与 DNA不同 DNA样品可先通过凝胶电泳进行分离 再用碱处理凝胶使DNA 变性 而 RNA 不能用碱变性 因为碱会导致 RNA 水解 因此 在 Northern 印迹 前 须进行 RNA 变性电泳 在电泳过程中使 RNA 解离形成单链分布在凝胶上 再进行印迹转移 RNA 变性电泳的原理 是用一定剂量的乙二醛 二甲基亚矾 或甲醛和甲基氢氧 化汞等处理 RNA 样品和凝胶 使双链 RNA 在电泳过程中变性而完全解离形成 单链 2 杂交反应的基本过程 杂交反应包括预杂交 杂交和漂洗几步操作 预杂交的目的是用非特异性 DNA 分子 鲑精 DNA 或小牛胸腺 DNA 及其它高分 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 子化合物 Denhart s 溶液 将待测核酸分子中的非特异性位点封闭 以避免这些位 点与探针的非特异性结合 杂交反应是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸 单链在一定温度和条件下进行复性反应的过程 杂交反应结束后 应进行洗膜处 理以洗去非特异性杂交以及未杂交的标记探针 以避免干扰特异性杂交信号的检 测 膜洗净后 将继续进行杂交信号的检测 1 以放射性标记探针与固定在 NC 膜上的核酸进行杂交为例 杂交反应操作如 下 配制所需试剂 SSC 溶液 20 3mol L NaCl 0 3mol L 柠檬酸钠 Denhardt s 溶液 50 聚蔗糖 5g 聚乙烯吡咯烷酮 5g 牛血清白蛋白 BSA 5g 加水至 500ml 预杂交液 6 SSC 5 Denhardt s 溶液 0 5 SDS 100 g ml 经变性或断裂成片 段的鲑精 DNA 将含靶核酸的 NC 膜漂浮于 6 SSC 液面 使其由下至上完全湿润 并继续浸 泡 2 分钟 将湿润 NC 膜装入塑料袋中 按 0 2ml cm2 的量加入预杂交液 尽可能挤出 气泡 将袋封口 置 68 水浴 1 2 小时或过夜 将双链探针做变性处理使成单链 即于 100 加热 5 分钟 然后立即置冰浴 使骤冷 从水浴中取出杂交袋 剪去一角 将单链探针加入 尽可能将袋内空气挤出 去 重新封口 并将杂交袋装入另一个干净的袋内 封闭 以防放射性污染 将杂交袋浸入 68 水浴 温育 8 16 小时 取出杂交袋 剪开 取出滤膜迅速浸泡于大量 2 SSC 和 0 5 SDS 中 室温 振荡 5 分钟 勿使滤膜干燥 将 NC 膜移入盛有大量 2 SSC 和 0 1 SDS 溶液的容器中 室温漂洗 15 分钟 将 NC 膜移入一盛有大量 0 1 SSC 和 0 5 SDS 溶液的容器中 37 漂洗 30 分钟至 1 小时 将 NC 膜移入一盛有新配 0 1 SSC 和 0 5 SDS 溶液的容器中 68 漂洗 30 分钟至 1 小时 取出滤膜 用 0 1 SSC 室温稍稍漂洗 然后置滤纸上吸去大部分液体 待做 杂交信号的检测 3 杂交信号的检测 当探针是放射性标记时