红细胞检验的基本方法PPT课件.ppt

1 铁指标检验的几个概念1 血清铁 serumiron 2 血清转铁蛋白 serumtransferrin 3 血清铁蛋白 serumferritin 4 血清总铁结合力 TIBC 5 转铁蛋白饱和度 一 SI serumiron 的测定1 原理SFPH 还原剂 Fe2 显色剂 络合物成年男性11 6 31 3 mol L成年女性9 0 30 4 mol L降低 见于缺铁性贫血 IDA 慢性失血和感染等 增高 见于肝疾病 铁粒幼细胞贫血 慢性溶血和反复输血等 二 SF serumferritin 的测定 125I标记SF 待测血SF 定量抗体 125I复合物1 复合物2125I标记SF 定量抗体 125I复合物32 参考值 成人男性15 200 g L 女性12 150 g L 小儿低于成人 3 临床评价 降低 见于IDA早期 失血 慢性贫血等 增高 见于肝疾病 血色病 急性感染和恶性肿瘤等 三 TIBC测定1 过量铁标准液 血清 SF2 SFPH 还原剂 Fe2 显色剂 有色络合物TIBC 男性50 77 mol L女性54 77 mol LUIBC 25 1 51 9 mol L 增高 见于IDA和红细胞增多症等 降低或正常 见于肝疾病 恶性肿瘤 溶血性贫血 慢性感染和肾病综合征等 四 铁吸收率测定当体内缺铁时 铁蛋白的利用加快 肠道对铁吸收也增加 口服放射性59Fe 测定体内59Fe放射性量比率的变化 可推算出铁吸收率 正常值 26 0 35 0 增加 见于IDA 可高达50 80 降低 见于肠道吸收不良综合征 正常 见于正常人 再障 巨幼细胞贫血 急性失血等 五 血清转铁蛋白测定免疫散射比浊法 利用抗人转铁蛋白血清与待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物 其光吸收和散射浊度增加 与标准曲线比较 可计算出转铁蛋白含量 免疫散射比浊法为28 6 51 9 mol L 增高 见于IDA和妊娠 降低 常见于肾病综合征 肝硬化 恶性肿瘤 炎症等 六 血清转铁蛋白受体测定双抗体夹心法 1 血清中转铁蛋白受体 抗体2 抗原抗体复合物 酶抗体 3 加入底物和显色剂 其颜色的深浅与转铁蛋白受体的量成正比 以不同浓度标准品的吸光度值绘制标准曲线 通过标准曲线查出未知标本的转铁蛋白受体水平 升高 常见于缺铁性贫血和溶血性贫血 降低 见于再障 慢性病贫血 肾功能衰竭等 用于临床观察骨髓增生状况和治疗反应 8 小低贫的初步诊断 1 HGB g L 男性 120女性 1102 HCT 0 35男性 0 40女性3 RBC 1012 L 男性 4 0女性 3 54 MCV fl 80fl 10 15L5 MCH pg 27pg 10 12g6 MCHC 0 32 9 血清铁指标检验的应用 小细胞低色素性贫血的鉴别铁总铁结合力铁饱和度铁蛋白缺铁贫减低增高减低减低 地贫正常正常正常正 高慢感贫减低正 低减低增高铁粒贫增高减低增高增高 一 血清和红细胞叶酸测定叶酸测定 measurementoffolacin RIA 核素 叶酸 放射碘叶酸化合物 血清叶酸 成年男性8 61 23 8nmol L叶酸减低 巨幼细胞贫血 红细胞过度增生 如溶贫 骨髓增生性疾病等 女性7 93 20 4nmol L红细胞与血清中的叶酸浓度相差几十倍 当未发生巨幼细胞贫血时 红细胞叶酸测定对判断叶酸缺乏尤其有价值 红细胞叶酸 成人340 1020nmol L红细胞 第二节叶酸和维生素B12的检验 二 血清维生素B12测定RIA法 用抗氧化剂和氰化钾在碱性环境下 pH 12 将人血清中的维生素B12从载体蛋白中释放出来 加入57Co标记的维生素B12 与固定在微晶纤维颗粒上纯化的维生素B12结合物竞争结合 检测其放射活性 其量与受检血清的维生素B12含量成反比 与标准管作对照 换算出维生素B12含量 成人148 660pmol L降低 巨幼细胞贫血 增高 白血病患者 真性红细胞增多症 恶性肿瘤和肝细胞损伤 四 血清内因子阻断抗体测定用57Co标记的维生素B12与血清中的内因子结合 形成57Co标记的维生素B12 内因子复合物 当存在内因子抗体时 形成的复合物的量减少 检测其放射活性 与阳性对照管进行比较 可得知内因子抗体的存在 阴性 正常人 比值 1 00 0 10阳性 比值 阳性对照血清比值 0 10内因子阻断抗体阳性 多见于由维生素B12缺乏引起的巨幼细胞贫血 恶性贫血等 红细胞寿命测定 erythrocytelifespandetermination 是将放射性核素 51Cr 标记的红细胞注入血循环后 逐日观察其消失率 记录成活曲线 计算出红细胞寿命 半寿期为25 32天红细胞寿命缩短 1 溶血性贫血 约为14天 2 再生障碍性贫血 约为15 29天 第三节溶血的检验 四 血浆高铁血红素白蛋白检测高铁血红素白蛋白 硫化铵铵血色原用光谱仪在绿光区558nm处有一最佳吸收区带 正常人呈阴性血管内溶血时 血浆中游离血红蛋白大量增加 血浆中可检测出高铁血红素白蛋白 15 1 原理 五 血清结合珠蛋白 Hp 测定1 待侧血清 Hb液 Hp Hb复合物 未结合Hb 2 电泳分离出Hp Hb复合物 电泳法0 5 1 6g L1 减低 常见于各种溶血 尤其是血管内溶血 排除严重肝病及传单 2 增高 感染 SLE 创伤 恶肿 妊娠等 六 尿卟啉检测尿中卟啉类物质在酸性条件下 经乙醚提取 于405nm处显红色荧光 从而可对尿卟啉进行定性检测 正常人呈阴性 增加 先天性红细胞生成性卟啉病 迟发性皮肤型卟啉病 肝红细胞生成型卟啉病等 对缺铁性贫血 铅中毒 铁粒幼细胞贫血和珠蛋白生成障碍性贫血等的诊断有一定价值 五 尿含铁血黄素试验又称Rous试验 当血红蛋白通过肾滤过时 部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞 并随尿液排出 尿中含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体 其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用 在酸性环境下产生普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀 尿沉渣肾小管细胞内外可见直径1 3 m的蓝色颗粒 正常人呈阴性 阳性提示慢性血管内溶血 尿中有铁排出 无论有无血红蛋白尿 只要存在慢性血管内溶血如PNH 本试验结果即呈阳性 并可持续数周 溶血初期 虽然有血红蛋白尿 此时本试验可呈阴性反应 一 红细胞渗透脆性试验渗透脆性试验 osmoticfragilitytest 检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力 红细胞在低渗盐溶液中 当水渗透其内部达一定程度时 红细胞发生膨胀破裂 开始溶血 75 2 82 1mmol L 4 4 4 8g L NaCl完全溶血 47 9 54 7mmol L 2 8 3 2g L NaCl 脆性增加 遗传性球形红细胞增多症 椭圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血性贫血 脆性降低 珠蛋白生成障碍性贫血 血红蛋白C D E病 低色素性贫血 肝疾病等 第四节红细胞膜缺陷的检验 二 自身溶血试验及其纠正试验红细胞在37 孵育48小时 其间由于膜异常引起钠内流倾向明显增加 ATP消耗过多 或糖酵解途径酶缺乏所引起ATP生成不足等原因可导致溶血 称为自身溶血试验 在孵育时 加入葡萄糖或ATP作为纠正物 观察溶血可否有一定的纠正 称为纠正试验 正常人红细胞孵育48小时 不加纠正物的溶血率 3 5 加葡萄糖的溶血率 1 0 加ATP纠正物的溶血率 0 8 遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加 加入葡萄糖或ATP后明显纠正 G 6 PD缺乏症等戊糖旁路代谢缺陷的病人自身溶血率增加 能被葡萄糖纠正 丙酮酸激酶缺乏症时不能利用葡萄糖产生ATP 其自身溶血率明显增加 加葡萄糖不能纠正 加ATP可纠正 获得性溶血性贫血或自身免疫性溶血时试验结果常各有不同 对诊断意义不大 本试验不够敏感和特异 仅对遗传性球形红细胞增多症有较大诊断价值 三 红细胞膜三磷酸腺苷活性测定Na K ATP酶 Ca2 Mg2 ATP酶和Mg2 ATP酶都是红细胞膜上的ATP酶 为测定酶的活性可分别测定酶作用于ATP的水解产物无机磷含量 若在基质中只加入Ca2 Mg2 ATP酶可测定Ca2 Mg2 ATP酶的活性 若在基质中加入Na K Mg2 和ATP 测定的为Na K ATP酶和Mg2 ATP酶的共同含量 再在基质中加入Na K ATP酶的抑制剂 测定结果仅为Mg2 ATP酶活性 两者的差为Na K ATP酶活性 红细胞膜Na K ATP酶 2 93 0 67 mU 109红细胞Ca2 Mg2 ATP酶 0 4 2 5 mol L 1 mg膜蛋白 h 1遗传性球形红细胞增多症 Na K ATP酶活性增加 Ca2 Mg2 ATP酶活性减低 蚕豆病 Ca2 Mg2 ATP酶活性降低 许多药物作用于红细胞时 Na K ATP酶和Ca2 Mg2 ATP酶活性改变 四 酸化甘油溶血试验当甘油存在于低渗溶液氯化钠磷酸缓冲液时 可阻止其中的水快速进入红细胞内 使溶血过程缓慢 但甘油与膜脂质又有亲和性 可使膜脂质减少 当红细胞膜蛋白及膜脂质有缺时 它们在pH6 85的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快 导致红细胞悬液的吸光度降至50 的时间 AGLT50 明显缩短 正常人AGLT50 290s遗传性球形红细胞增多症AGLT50明显缩短 25 150s 自身免疫性溶血性贫血 肾功能衰竭 妊娠等AGLT50也可缩短 五 高渗冷溶血试验在高渗状态下 温度骤然变化影响红细胞膜脂质的流动性 并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白结合位点 红细胞容易破裂而发生溶血 当膜蛋白缺陷致膜表面积与体积比值降低 溶血率明显增加 而膜表面积与体积比值增加 溶血率降低 高渗冷溶血试验 hyperosmoticcoldhemolysistest 即测定红细胞在不同浓度的高渗缓冲液中 从37 水浴立即置于0 水浴一定时间的最大溶血率 9mmol L或12mmol L蔗糖最大溶血率66 5 74 1 7mmol L蔗糖大溶血率0 1 16 9 遗传性球形红细胞增多症明显增加 珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病明显降低 自身免疫性溶血性贫血基本正常 2 参考值 六 红细胞膜蛋白电泳分析将制备的红细胞膜样品进行SDS PAGE SDS 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 根据样品中各蛋白相对分子质量的不同 分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱 从而可见各膜蛋白组分百分率 各种膜蛋白组分百分率变化较大 多以正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较 或以带3蛋白为基准 各膜蛋白含量以与带3蛋白的比例表示 许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常 各种膜缺陷疾病如遗传性球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常 某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常 一 高铁血红蛋白还原试验在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白变成高铁血红蛋白 正常红细胞的G 6 PD催化戊糖旁路使NADP变成NADPH 其脱的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白 Fe3 还原成亚铁血红蛋白 Fe2 通过比色可观察还原的多少 当G 6 PD缺乏时 高铁血红蛋白还原率下降 正常人高铁血红蛋白还原率 75 脐带血 77 G 6 PD缺乏时 高铁血红蛋白还原率下降 中间缺乏 杂合子 为31 74 严重缺乏 半合子或纯合子 30 第五节红细胞酶缺陷的检验 二 变性珠蛋白小体生成试验G 6 PD缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于37 孵2 4小时 用煌焦油蓝染色观察红细胞中珠蛋白小体的生成情况 计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率 正常人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞 一般 30 G 6 PD缺乏症常高于45 故可作为G 6 PD缺乏的筛检试验 但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高 不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为75 84 HbH病和化学物质中毒时也增高 三 葡萄糖 6 磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定在G 6 PD和NADP 存在下 G 6 PD能使NADP 还原成NADPH 后者在紫外线照射下会发出荧光 NADPH的吸收峰在波长340nm处 可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G 6 PD活性 正常人有很强的荧光 G 6 PD缺陷者荧光很弱或无荧光 杂合子或某些G 6 PD变异者则可能有轻到中度荧光 正常人酶活性为 12 1 2 09 U gHb 四 丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定在二磷酸腺苷 ADP 存在的条件下丙酮酸激酶 pyruvatekinase PK 催化磷酸烯醇丙酮酸 PEP 转化成丙酮酸 在辅酶 还原型 NADH 存在的情况下丙酮酸被LDH转化为乳酸 若标记荧光于NADH上 此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD 正常人丙酮酸激酶活性斑点在25分钟内消失 酶活性 15 0 1 99 U gHb 荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏 中间缺乏 杂合子 时 荧光25 60分钟消失 严重缺乏 纯合子 时 荧光60分钟不消失 五 谷胱甘肽还原酶缺陷检测谷胱甘肽还原酶 GR 催化反应中NADPH转变为NADP 荧光消失 通过在365nm处观察荧光斑点消失的时间 GR荧光斑点试验 反映谷胱甘肽还原酶的活性 或直接测定吸光度的变化 GR活性定量试验 计算GR的活性 GR荧光斑点试验 正常人荧光斑点15min内消失GR活性定量 7 17 1 09 U gHb谷胱甘肽还原酶缺乏时 GR荧光斑点试验15分钟以后还有荧光存在 GR活性定量试验活性低于7 17U gHb 一 红细胞包涵体试验红细胞包涵体试验 Heinz bodyformingtest 是将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育 不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体 正常人 1 不稳定血红蛋白病 孵育1 3小时多数红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体 G 6 PD缺乏或红细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等 红细胞中也可出现包涵体 HbH病 孵育1小时就可出现包涵体 也叫HbH包涵体 第六节血红蛋白异常的检验 1 原理 二 血红蛋白电泳检测 血红蛋白电泳 hemoglobinelectrophoresis 是根据不同的血红蛋白所带电荷不同 相对分子质量不同 其泳动方向和速度不同 经一定电压和时间的电泳 可分离出各自的区带 同时对电泳出的各区带进行电泳扫描 可进行各种血红蛋白的定量分析 2 参考值 1 pH8 6TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳 正常血红蛋白电泳区带 HbA 95 HbF 2 HbA2为1 0 3 1 通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较 可发现异常血红蛋白区带 如HbH HbE HbBatrs HbS HbD和HbC等异常血红蛋白异常 HbA2增多 见于 珠蛋白生成障碍性贫血 为杂合子的重要实验室诊断指标 HbE病时也在HbA2区带位置处增加 但含量很大 在10 以上 HbA2轻度增加亦可见于肝病 肿瘤和某些血液病 三 抗碱血红蛋白检测将待检的溶血液与一定量的NaOH溶液混合 作用1分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应 胎儿血红蛋白 HbF 抗碱变性作用强 没有变性存在于上清液中 HbA变性沉淀 取上清液于540nm处测定吸光度 检测出HbF的浓度 此试验也称为碱变性试验 成人 2 新生儿 40 HbF绝对增多 珠蛋白生成障碍性贫血 重型者达30 90 中间型常为5 30 轻型小于5 遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者 可高达100 HbF相对增多可见于骨髓纤维化 白血病 浆细胞瘤等恶性疾病及再生障碍性贫血 PNH 卟啉病等 HbF生理性增多见于孕妇和新生儿 四 HbF酸洗脱法检测HbF具有抗碱和抗酸作用 其抗酸能力比HbA强 将血涂片于酸性缓冲液中孵育 含HbF的红细胞不被酸洗脱 可被伊红染成红色 而含HbA的红细胞均被酸洗脱 不能被伊红着色 正常血片中含HbF的着色红细胞 成人 0 01 1 新生儿0 55 0 85 55 85 以后渐渐下降 2岁后幼儿 0 02 2 孕妇可有轻度增加 着色细胞增加 珠蛋白合成障碍性贫血重型患者大多数红细胞染成红色 轻型患者可见少数染成红色的细胞 遗传性胎儿血红蛋白持续综合征红细胞均为红色 五 异丙醇沉淀试验不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解 在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键的非极性溶剂中 不稳定血红蛋白更快地沉淀 通过观察血红蛋白液在异丙醇中的沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检 正常人血红蛋白液为阴性 30分钟内不沉淀 不稳定血红蛋白存在时 常于5分钟时出现沉淀 20分钟开始出现绒毛状沉淀 血液中含有较多HbF HbH HbE时也可出现阳性结果 六 热变性试验热变性试验 heatinstabilitytest 是根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性 观察血红蛋白液在50 时是否出现沉淀 对不稳定血红蛋白进行筛检 正常人热沉淀的血红蛋白 1 血红蛋白沉淀率增加 说明不稳定血红蛋白存在 七 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测尿素或对氯汞苯甲酸能破坏血红蛋白的空间结构 血红蛋白的珠蛋白可被裂解成肽链亚单位 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出各肽链区带 正常血红蛋白HbA裂解后出现 HbA HbA2和 四条带 本试验若有异常血红蛋白肽链的区带出现 表示有异常血红蛋白存在 对珠蛋白生成障碍性贫血的诊断和鉴别有参考价值 2 参考值 正常人 阴性 一 酸化血清溶血试验酸化血清溶血试验 也称Ham stest 即红细胞在酸性 pH6 4 6 5 的正常血清中孵育 补体被激活 PNH红细胞破坏而产生溶血 而正常红细胞不被溶解 无溶血现象 本试验阳性主要见于PNH 某些自身免疫性血性贫血发作严重时可呈阳性 第七节PNH的检验 1 原理 二 蔗糖溶血试验蔗糖溶血试验 sucrosehemolysistest