HPLC分析中的拖尾原因.doc

一、什么原因导致反相 HPLC 的峰拖尾，应采取什么措施？由于被分析物与色谱柱间的相互作用导致峰拖尾。这种相互作用是在做反相分析中所发生的分配行为以外的作用。峰拖尾一般发生在碱性化合物上，通常是由于残留的硅羟基和带正电荷的碱性化合物之间的相互作用引起的。这种相互作用一般是发生在带正电荷的碱性化合物与带负电荷的色谱柱表面硅羟基之间的离子交换。当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时， 色谱柱表面的硅羟基会带负电荷。因此，(1)消除峰拖尾的最有效方式是使用 pH 值小于 4 的缓冲流动相。由于硅羟基的活性和离子化会降低，因此(2)选择更换新的高纯羟基化硅胶色谱柱也会减少峰拖尾。 ZORBAX 色谱柱中使用这类硅胶的有：StableBond 色谱柱、Eclipse XDB 色谱柱、Bonus-RP 和 Extend-C18 色谱柱。这些色谱柱均可以减少峰拖尾，但是它们又有所不同。StableBond (SB) 色谱柱在低 pH 值时比较理想，因此在使用较低 pH 值的流动相时通常是首选色谱柱。在 pH 值为 5-9 时Eclipse XDB 色谱柱是减少峰拖尾的首选色谱柱。这类色谱柱有双重封端，因此它可以通过覆盖色谱柱表面上尽可能多的残留硅羟基以消除可能的硅羟基副作用，从而减少峰拖尾。对于这个中间 pH 值区，Bonus-RP 色谱柱也是一个减少峰拖尾的不错选择。Bonus-RP 色谱柱有一个植入极性物质的键合相。这些极性物质可减少碱性化合物和残留硅羟基之间的相互作用，因此改善碱性化合物的峰形。这类色谱柱可以在 pH 值为 2-8 的条件下使用。Extend-C18 用于高 pH 值，最高可用于 pH 值为 11.5 的条件下。在较高 pH 值下，很多碱性化合物已经不带电荷，因此和硅羟基的相互作用减小，峰拖尾也减少。 (3)认真选择流动相也可以减少峰拖尾。缓冲流动相 (2550 mM) 可减少峰拖尾，同时首选低 pH 值 (pH 23) 流动相。这还会产生更多的可再生色谱。如果需要的话，可以添加一些流动相添加剂如三乙胺 (TEA) 以减少碱性化合物的峰拖尾。TEA 相当于竞争物，占据硅羟基的位置，用于消除分析物与残留硅羟基间的相互作用。但在低 pH 值时很少需要这类添加剂，仅在中间 pH 值时才偶尔需要。 如果遇到酸性化合物的峰拖尾，处理过程相同。降低流动相的 pH 值以尽量使酸质子化，然后使用缓冲流动相并尽量增强流动相的离子强度。最后，可以通过向流动相中加入竞争的有机酸，我们已经使用 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 得到了比较好的结果，并且这种添加剂具有比较低的紫外截止值。按照这些建议应该可以减少酸性和碱性物质的峰拖尾。 现在大多数色谱柱使用球形粒子，因为这种使用球形粒子填充的色谱柱具有更高的效率。因此，从选择一个球形粒子色谱柱开始。分析分离最常用的粒子大小为 5um，这是因为这种粒子比较容易使用，但现在更佳的选择为 3.5um 的粒子。这些更小的粒子在更短的柱长度内可产生更高的效率，可以在更短的分析时间内进行分离。如果分析时间对于您很重要，则可以考虑选择 ZORBAX 快速分析 (3.5um) 色谱柱以缩短分析时间。这个 4.6 x 150mm，3.5um 的快速分析色谱柱与 4.6 x 250mm， 5um 的色谱柱具有相同的效果，但分析时间却缩短 40%。如果想进一步缩短分析时间，则还可以选择其它时间更短的快速分析色谱柱（75mm、50mm、30mm 和 15mm）。 对色谱柱孔尺寸的选择取决于分析物的分子量。孔尺寸小于 100 的色谱柱可以用于分析分子量小于 4000 的小分子。更大的分子，例如蛋白质和缩氨酸，应选择孔尺寸为 300 的色谱柱进行分析。另外，一些具有大的多环刚性结构的小分子最好采用孔尺寸为 300 的色谱柱。选择合适的孔尺寸非常重要，这是因为大多数键合相停留在粒子孔内，因此仅当分子能够容易迅速地进出孔时，才能获得最佳的停留时间和峰宽。 二、拖尾原因及解决办法中国色谱网(2008-4-1 9:22:18)文章作者：未知色谱峰拖尾的原因有很多，例如：1色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷；柱坏；2柱头有污染；3样品超载；4样品溶剂不合适；5柱外效应；6化学或二次保留（硅羟基）效应；7 缓冲容量不足或不合适； 8 重金属污染。解决方法如下： 一、与化学有关的拖尾问题 ?1流动相中，加入30mM的三乙胺（用于碱性化合物）或醋酸胺（用于酸性化合物）， 未知化合物加醋酸三乙胺； 2如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3.降低进样量至1g。 二、 与色谱柱有关的拖尾问题 1.如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；2.使用保护柱。 三、 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽1.进样体积过大，（通