组织制片技术概述.ppt

组织制片技术主讲 张端莲 组织制片的意义和目的组织标本制作的方法组织切片标本制作的基本程序苏木精 伊红染色的程序 组织制片的意义和目的组织制片技术是随着生命科学的发展而不断进步的 利用组织切片染色 staining 的方法所制出的标本显示了各种组织细胞的不同结构和形态 它们之间的相互连接及它们之中的某些化学成分的种类和含量的变化 为细胞分子学的研究提供了最直观的依据 因此组织制片是研究医学和生物学的一个最基本和最重要的手段 组织标本制作的方法 组织切片法非组织切片法 组织切片法利用化学试剂将组织经过一系列的固定 fixation 脱水 透明后 再利用石蜡或火棉胶和明胶等支持物渗透进组织内部 使组织保持一定的硬度 并包埋 embedding 成块 然后依靠切片机 microtome 将包埋好的组织块切成以微米计的薄片 再根据需要进行各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法 石蜡切片 火棉胶切片 明胶切片冰冻切片 非组织切片法组织不经过切片手续制成的观察标本的方法为非组织切片法 包括 涂片 压片 铺片 磨片 消化分离 活体标本 整装标本 血管注射标本 涂片将所采的血液或骨髓样品涂抹于载玻片上经瑞氏或姬姆萨染色后的标本 压片先将组织处理成小块物质 然后经化学药品软化和染色 再用盖玻片压封于载玻片上的标本 例如运动终板等 铺片将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于载玻片上 然后经过固定 染色等程序制成的标本 例如蛙的肠系膜铺片 大白鼠的皮下组织铺片等 磨片骨 牙齿等组织 不经脱钙和切片 直接在磨石上用手工磨成大约50微米左右的薄片 然后再进行染色封固在载玻片上的标本 消化分离将组织分离成小块 然后利用相应的化学药品水溶液将其细胞间质消化溶去 再用机械分离的方法 如利用水的震荡冲击力等 使小块组织分离成单个而又完整的细胞 经染色后涂于载玻片上封固的标本 例如平滑肌分离标本 脊髓的运动神经细胞等 活体标本将所采的观察标本加生理盐水后直接滴于载玻片上在显微镜下观察 整装标本一种是将胚胎或小动物经前期固定后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中 另一种是将发育至某一阶段的鸡胚整体取出 经固定 染色 脱水 透明后封固于载玻片上的标本 血管注射标本一种是将有色物质注射进血管 用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血管标本 另一种是将有色物质注射进血管后 经一系列制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本 组织切片标本制作的基本程序 取材 固定 固定后处理 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 染色 封固 取材动物的处死处死动物要求手法迅速 快捷 避免动物因过度痛苦而产生组织细胞的变化 处死动物的几种常用方法 麻醉法空气栓塞法击头法颈椎脱臼法破坏脑和脊髓股动脉放血 取材的方法 选择动物选择取材部位选择切面方向 根据实验工作的目的选择动物取材应根据实验工作的目的选择动物的种类 组织部位和材料大小 肝脏 猪肝卵巢 猫胃 狗运动终板 爬虫类动物肥大细胞 大 小白鼠的皮下组织间皮和内皮 蛙的肠系膜铺片最好 根据器官组织的结构特点选择部位 胰腺 胰尾部脊髓的运动神经元 颈膨大和腰膨大处肺 肺门胃 胃底部 根据器官组织的结构特点选择切面方向肾脏 肾门处作纵切头皮 顺毛根的方向纵切大小肠的环行皱襞 纵切气管和食管 横切 应注意的问题 组织新鲜注意环境温度的影响材料应小而薄1 5 1 5 0 5厘米3防止组织变形防止组织损害防止组织污染 固定和固定剂 固定的目的 防止组织细胞产生自溶和腐败使细胞易于着色使组织适度硬化 固定的方法 直接固定蒸汽固定灌注固定 局部灌注固定全身灌注固定 固定的注意事项 固定剂的用量一般为组织块体积的15倍左右固定剂的配制现配现用最为理想还原剂 如甲醛 尽量不要与氧化剂 如重铬酸钾 配伍固定的时间一般情况下固定24小时既可达到固定要求 固定后处理 流水冲洗脱黄脱汞脱甲醛色素组织漂白脱钙 酸溶液脱钙 螯合脱钙 电解脱钙 固定剂单纯固定剂甲醛 乙醇 冰乙酸 升汞 苦味酸 重铬酸钾 丙酮 铬酸 四氧化锇混合固定剂中性甲醛液 乙醇 甲醛液 Bouin氏液 苦味酸 硫酸液 Carnoy氏液 Helly氏液 甲醛 Formeldedhyde 固定浓度 10 20 水溶液固定时间 12小时 24小时固定后处理 流水冲洗12小时 24小时配制方法 甲醛原液10ml 20ml生理盐水 或蒸溜水 90ml 80ml特性 甲醛原液浓度为40 甲醛放置时间过长易产生白色沉淀 三聚甲醛 氧化后变为甲酸 使溶液变为酸性 严重时可影响到细胞核着色 因此需长期保存的甲醛溶液应加入适量的碳酸镁或碳酸钙作为中和剂 酸性甲醛固定的组织易产生甲醛色素 固定后须用硷性溶液洗涤 乙醇 Ethylalcohol 固定浓度 80 90 乙醇液固定时间 一般4小时 12小时固定后处理 直接入脱水剂配制方法 无水乙醇80ml 90ml蒸馏水20ml 10ml特性 乙醇易被氧化成乙醛继而变为醋酸 所以不能与铬酸 重铬酸钾 锇酸等氧化剂混合 乙醇具有固定 脱水等多种功能 单独作固定剂使用时其渗透力较差 因此取材应薄 才能固定好 经乙醇固定的组织细胞核着色较差 高浓度乙醇 通常指90 浓度以上 不溶解细胞内糖原 宜做保存糖原的固定剂 组织在高浓度乙醇中放置时间过长时 收缩明显 易发脆 影响制片 50 以上浓度的乙醇可溶解组织内脂肪 类脂体 色素等 因此不能用作以上物质的固定剂 中性甲醛液配制方法 40 甲醛120ml蒸馏水880ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠13g固定时间 24小时 固定后处理 流水冲洗24小时 适用组织 实验室常备固定剂 适用多种组织的固定 乙醇 甲醛液 A F液 配制方法 95 乙醇90ml40 甲醛10ml固定时间 组织块固定4 12小时 铺片固定5 10分钟 固定后处理 直接入脱水剂 适用组织 组织中的肥大细胞 组织化学中对糖原的固定等等 Bouin氏液 固定皮肤苦味酸 硫酸液 胚胎组织 尤以固定鸡胚最好Carnoy氏液 糖原 染色体 尼氏体等Helly氏液 骨髓 脾 肝等造血器官及胰岛 脑垂体前叶等含特殊颗粒的细胞 脱水和脱水剂 脱水脱水剂乙醇 丙酮 正丁醇乙醇既是固定剂又是实验室常用脱水剂 脱水能力强 能与二甲苯等透明剂较好地混合 用乙醇脱水时遵循从低浓度向高浓度的梯度脱水原则 一般组织从70 浓度开始至无水乙醇 胚胎组织从30 浓度开始 组织在高浓度乙醇中停留时间不能过长 否则将会使组织脆化 丙酮沸点56 脱水能力比乙醇强 但对组织的收缩脆化作用也比乙醇强 因此主要用于组织的固定兼脱水或切片的快速脱水 以保护某些特殊染色的标本不被褪色 正丁醇沸点100 118 脱水能力较弱 但很少引起组织的收缩和脆化 因能与乙醇和石蜡混合 因此经正丁醇脱水的组织可直接浸蜡包埋 脱水方法 组织块经固定洗涤后入50 70 和80 乙醇中作基础脱水 然后转入正丁醇中脱水12 24小时 再浸蜡包埋 透明和透明剂 透明透明剂二甲苯 苯甲酸甲脂 三氯甲烷 冬青油二甲苯为无色透明的液体 易挥发 长期接触对呼吸道粘膜有较强的刺激作用 二甲苯透明能力强 但组织在二甲苯中浸泡时间过长时较易发生过度收缩和脆化现象 用二甲苯透明时 小块组织20分钟至1个小时 大块组织可适当延长时间 如果组织块在透明时呈白色浑浊不透明状态时 则为脱水不彻底所致 此时应返回重新脱水 苯甲酸甲脂为无色透明的液体 易挥发 透明能力强 对组织块的收缩和脆化的影响较小 透明时间12 24小时 组织块经各级乙醇至95 浓度脱水后可直接入苯甲酸甲脂透明 由于苯甲酸甲脂可溶解火棉胶 也可用于火棉胶切片的透明 三氯甲烷也称氯仿 无色透明的液体 极易挥发 透明能力较差 透明时间可长达24小时 但氯仿不易使组织收缩和变脆 目前广泛用于火棉胶胶块的透明 冬青油 浸蜡 用于组织块浸蜡的石蜡分为低溶点蜡和高溶点蜡 低溶点蜡溶点在48 50 也称软蜡 高溶点蜡溶点在60 62 也称硬蜡 因此 浸蜡的恒温箱相应地分为软蜡箱和硬蜡箱两种 软蜡箱的温度控制在52 54 之间 组织浸蜡时间一般可达2 4小时 硬蜡箱的温度控制在62 64 之间 组织浸蜡时间一般不超过1小时 组织块浸蜡的成功与否与温度和时间有很大的关系 温度愈高 时间愈长 则组织块的收缩愈大 脆化愈明显 包埋组织浸蜡完成后 接着进行组织块包埋 用于包埋的是硬蜡 使用前须在恒温箱中多次溶化 利用热胀冷缩的原理挤出原石蜡里的空气 再加入一定数量的 约十分之一 蜂蜡 或旧蜡 相混合 提高石蜡的密度和粘度 以使切片时便于形成完整的蜡带 蜂蜡也称黄蜡 是一种动物蜡 溶点约在54 粘滞度比石蜡高 组织块包埋一般采用包埋框来进行 包埋框由两块 L 型的金属框和一块金属底板相对拼合而成 包埋组织时应注意将组织块的切面朝下放平 包埋镊应加温后使用 组织包埋好后 应等石蜡凝固后才可将包埋框打开 修整蜡块时 组织块应距蜡块边缘2 3毫米 以利于连续切片 切片 石蜡切片用石蜡作为包埋剂制作的切片称为石蜡切片 是组织切片中应用最为广泛的一种切片 其优点是易于制作大量菲薄的组织标本 而且石蜡包埋块又可长期保存 仪器及器材准备切片机切片刀恒温水箱式摊片仪经过清洁处理的载玻片眼科弯镊子中号羊毫毛笔粘片剂 切片过程 调节水温至47 左右 固定蜡块 修整包埋面 调节切片厚度至4 6微米 切片 摊片 烤片 切片的注意事项 切片前要将切片机各部位的螺丝旋紧 否则会引起切片机各部件震动 造成切片厚薄不匀 块的切面和切片刀的倾斜度之间的夹角应按切片机刀台上的刻度作适当调整 恒温水箱的温度应比包埋蜡的溶点低5 6 环境温度高时蜡块容易变软 应使用冰块使蜡块的表面迅速冷却 以增加蜡块表面的硬度 骨切片骨组织作切片观察 必须将骨的钙质除去 仅保留软组织才能切片 这一过程就是 脱钙 脱钙将厚约2 3mm的骨片放入脱钙剂中24 48小时脱钙剂 浓硝酸5ml尿素3 5g蒸馏水100ml脱钙后可按一般组织标本的脱水 透明 包埋 切片及染色过程进行处理 骨髓切片 冰冻切片 染料和染色 染料是指分子中含有发色团和助色团的有机化合物 有鲜艳的色彩 对于组织有极强的亲和力 根据来源可分为两类 天然染料 卡红 苏木精 人工合成染料 苦味酸 桔黄G 根据其化学性质分为 碱性染料 basicdye 酸性染料 aciddye 中性 neutrophilia 染料 染色的原理 化学反应在组织细胞内一般认为都含有酸性物质和碱性物质 染色时酸性物质与碱性染料中的阳离子结合 碱性物质与酸性染料中的阴离子结合 在细胞核中主要由酸性物质组成 如核酸等 所以与苏木精等碱性染料有很强的亲和力 细胞质主要由硷性物质组成 所以与伊红等酸性染料有很强的亲和力 能被碱性染料着色的物质称为嗜碱性 basophilia 物质 能被酸性染料着色的物质称为嗜酸性 acidophilia 物质 物理反应 吸附作用 染色的注意事项 溶媒浓度温度其它注意事项 媒染剂 促染剂和分化剂媒染剂凡能增强染料对组织的着色能力 其本身又能与染料或组织发生结合的化学试剂称为媒染剂 如配制各种苏木精染色液时添加的钾明矾 铵明矾等 促染剂能增强染料对组织的着色能力 但本身并不参与染色反应 如伊红染色液中添加的冰乙酸等 分化剂能除去组织上和切片上过染的染色液 使受染的部位与周围组织对比鲜明 着色深浅适当 更便于观察细胞的结构 分化剂又分为酸性分化剂 例如低浓度的盐酸 醋酸等 氧化分化剂例如高锰酸钾 重铬酸钾等 媒染分化剂如铁明矾等 封固和封固剂 封固组织切片制片的最后一道程序是滴加封固剂 用盖玻片复盖于载有组织片的载片上 以利于镜下观察 并借以阻断组织片与外界的接触 从而防止组织片脱片 受潮 干裂 机械磨损等 延长切片的使用时间 这一步骤称为封固 封固分为干封和湿封两种 封固时的注意事项 无论干封和湿封 在封固切片时都必须注意避免产生气泡 封固剂应浓度适中 过稀或过浓均影响封固 选择大小合适的盖玻片 以盖好组织后四周约有2毫米左右的余隙为适当 封固剂应避光保存 苏木精 伊红染色的程序 苏木精 hematoxylin 伊红 eosin H E染色 脱蜡与入水1 二甲苯 5 10分钟 二甲苯 5 10分钟 2 无水乙醇 1 2分钟 无水乙醇 1 2分钟 3 95 乙醇1 2分钟 4 80 乙醇1 2分钟