实验四、基因组DNA的提取和检测(阳成伟).ppt

实验四 基因组DNA的提取 准备 一次性手套 65 水浴锅 氯仿 无水乙醇 1 5离心管 菜花 实验目的 1 了解真核生物基因组DNA提取的一般原理 2 了解基因组DNA的实验用途 3 掌握基因组DNA提取的方法和步骤 材料 花椰菜 昆虫组织设备 移液器 高速离心机 水浴锅 培养箱 试剂 1 CTAB组织消化液2 氯仿3 无水乙醇4 TE缓冲液 CTAB溶液配制 2 CTAB溶液 100mmol LTris HCl pH7 0 1 4mol LNaCl 20mmol LEDTA 2 CTAB 实验原理 CTAB法 CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 是一种阳离子去污剂 可使细胞破裂 释放出核酸 CTAB溶液中含有1 4mol LNaCl 有助于溶解释放出来的DNA DNA在2mol LNaCl中DNA具有较高的溶解度 加入无水乙醇 可以使DNA从溶液中沉淀出来 实验步骤 常温操作 2人一组 取适量 300 500mg 植物组织 加入2mlCTAB抽提缓冲液 充分匀浆2 3min 然后每人转移700ul的匀浆液至一支1 5ml离心管中 65 水浴45min 中间摇动2 3次 裂解细胞 释放核酸和蛋白 加入700ul的氯仿 上下摇动2 3min 此步是萃取组织液中的蛋白质 务必带上手套 12000rpm离心10min 取400ul上清液转移至一支1 5ml离心管中 由于此时悬液已经分层 而我们需要取最上层的溶液 所以注意千万不要使枪头触碰到中间的杂质层 当然 更不能取吸取下层的萃取液了 加入1 10体积的NaAc 3mol L pH5 2 40ul 上下颠倒3 4次混匀 然后再加入2倍体积的无水乙醇 0 9ml 上下颠倒3 4次混匀 如DNA量大 此时可见絮状DNA沉淀 如果放置于 20度过夜 DNA产率会更多 12000rpm离心5min 缓缓倒掉上清液 剩余的液体可以用移液器吸走 管底的沉淀即DNA 无色透明胶状物 加入200ulTE缓冲液 含50ug mlRNase 轻弹管底 以溶解DNA 也可以用枪头缓慢地来回吸放液体来帮助溶解DNA 此时应该可以看到片状的DNA沉淀物逐渐变少 最终消失 一定要使DNA完全溶解于TE中 否则影响电泳效果 将DNA溶液置于37 培养箱或水浴中30min 降解残留的RNA 20 保存备用 取5 10ulDNA 加适量loadingbuffer 电泳检测 取2ulDNA测定浓度和OD260 280 下次课电泳检测 基因组DNA的检验 纯度 紫外分光光度法 核酸在260nm处有最大吸收峰蛋白质在280nm处有最大吸收峰盐和小分子在230nm处有最大吸收峰1 72 0 基因组DNA的检验 完整性 凝胶电泳法 基因组DNA电泳 在电场中泳动慢 如果发生降解 可出现电泳图谱脱尾现象 M123456M123456 上样2ul 上样8ul 注 1 6序号分别与表中对应 核酸的贮存 DNA保存 1 短期贮存 4 或 20 存放于TE Tris和EDTA 缓冲液中 TE缓冲液 PH为8 0 可减少DNA脱氨反应 EDTA可以抑制DNase的活性 2 长期贮存 TE缓冲液中 70 保存数年 无水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等盐离子 作用是中和核酸分子表面的负电荷 减少分子间的排斥力 有助于分子之间的聚集 无水乙醇可以吸收分子之