枸杞多糖的提取与鉴定.doc

枸杞多糖的提取与鉴定 1242818杨立君实验原理强酸可以使糖类脱水生成糠醛。生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。颜色的深浅可以作为定量的标准。这一方法具有很高的灵敏度，糖含量在30g左右就能进行测定，所以可以作为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。实验试剂1.标准葡萄糖试剂：将葡萄糖105烘干至恒重（2h），准确称取50mg,无离子水定容至500mL,终浓度为0.1mg/mL.2.蒽酮-浓硫酸试剂：称取0.1997g蒽酮，溶于100mL浓硫酸，现用现配。3.葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖4.硫代硫酸钠溶液，活性炭，正丁醇，无水乙醇，丙酮。三氯甲烷，甲苯胺乙醇溶液实验器材分光光度计，超速离心机，电炉，烧杯，试管，干燥器，滤纸，层析缸以及其他相关玻璃仪器实验流程(一) 提取枸杞干果粉碎，氯仿- 甲醇（21）回流脱脂810 h 近无色，挥干溶剂以后将脱脂后的枸杞样品放入烧杯中，分3次加15、12、10 倍量的蒸馏水于90 水浴提取，每次2 h；收集3 次的滤液减压浓缩至约200 mL，转移到大烧杯中，加4 倍量的95%乙醇，沉淀12 h 后抽滤，并依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，干燥后便得到枸杞多糖的粗制品。（二）纯化多糖粗品加水溶解，4 000 r/min 离心10 min 后取上清液，加30%双氧水适量，40 保温46 h 后，加三氯甲烷-正丁醇（41，Sevag 法）溶液沉淀蛋白，取上清液；此步骤反复多次，直到无白色絮状沉淀出现。将除去蛋白的多糖溶液浓缩后，转移到分子排阻为8 00010 000 Da 的透析袋中，流水透析24 h 后，蒸馏水透析过夜，溶液颜色变淡，浓缩后真空干燥得枸杞多糖精制品。(三) 理化性质分析将枸杞多糖精品分别加入水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇中，观察其溶解性。另在浓硫酸存在下观察枸杞多糖与-萘酚的作用，于界面处观察颜色变化。 （四）蒽酮比色法测定含量1. 制备标准曲线：取六只试管，如下表进行操作： 管号步骤012345标准溶液，ml00.10.20.30.40.5蒸馏水,ml10.90.80.70.60.5置冰浴5min蒽酮试剂,ml444444沸水浴中准确煮沸10min,自来水冷却,室温放置10min后,比色A6202. 样品含量测定吸取1ml多糖溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出后自来水冷却，620nm比色，其他条件与做标准曲线相同。测得吸光度值由标准曲线查处出样品液的糖含量。（如果样品管的吸光度值超出标准曲线范围，需将样品进行适当的稀释，再取1mL进行鉴定）。3,计算根据所测的吸光度平均值，根据标准曲线，求得糖含量（微克），记为式中表示1mL样品测定液的多糖含量（g）;表示多糖提取液的体积（mL）;n表示测定液的稀释倍数；m表示枸杞的质量。(五) 枸杞多糖及单糖鉴定纸层析1. 以正丙醇-浓氨水-水为展开剂，分别将枸杞多糖粗品和精品溶于水中，点样于层析滤纸上，展层后吹干，以甲苯胺乙醇溶液染色，乙醇漂洗。2. 将层析滤纸剪成纸条，将多糖样品水解液点样，近旁点已知组分的标准混合液。滤纸条悬挂于层析缸中层析，纸条在显色剂中浸泡一下，悬于空气中，用NaOH-乙醇液喷雾于滤纸上至完全润浸并显出色斑，干燥，浸入硫代硫酸钠溶液中定影。与已知组分的标准单糖混合物所显的色斑对比，就可鉴定多糖样品中单糖的成分。参考文献1侯新东，盛桂莲，葛台明，李继红.生物化学实验指导书M.武汉：中国地质大学出版社有限责任公司,2011年12月第一版2苟春林，苟金萍，张艳，王晓菁，姜瑞.枸杞多糖的提取分离及其组成研究J,宁夏农林科技，2012，53（05）：89-90，923武金霞.生物化学实验教程M,北京：科学出版社，2012年8月第一版4刘军海, 任惠兰, 李风风, 李广录.响应面分析法优化枸杞多糖提取工艺条件J,时珍国医国药2008年第19卷第4期Data Analysist/min1722243545558510.06010.02010.0109.9309.8709.7859.56512.9112.8712.861