评价软胶囊中明胶交联反应的相关指标间的相关性及影响因素.doc

评价软胶囊中明胶交联反应的相关指标间的相关性及影响因素摘要：目的评价明胶交联反应指标间的相关性，考察影响软胶囊中明胶交联反应的因素，探讨软胶囊溶出迟缓机理。方法采用甲醛处理软胶囊囊壳模拟交联反应，进行明胶溶胀动力学和溶出度实验，采用 INBS法测定 一氨基酸含量。应用差示热扫描分析明胶结构的变化。结果 明胶交联后，平衡膨胀量(S 。)、百分溶出量和氨基酸含量之间呈良好线性关系；平衡膨胀量、氨基酸含量与软胶囊崩解时问呈良好线性关系；在40或光照(4 500500)ix条件下放置的软胶囊囊壳的S 显著低于室温避光下放置的软胶囊(P001)；甘氨酸和焦亚硫酸钠能有效阻止S 的降低；明胶发生交联后，分子中螺旋一卷曲转变消失。结论明胶平衡膨胀量(S )、百分溶出量和氨基酸含量从不同角度反映交联反应程度，有良好相关关系(r=0995 30998 5)；高温、光线会促发明胶交联反应；抗氧剂能延缓交联反应的发生；明胶分子中螺旋一卷曲转变消失，水化作用减弱，是软胶囊溶出迟缓的主要原因。软胶囊在储存期出现崩解或溶出迟缓现象，是软胶囊研制和生产中遇到的常见问题，已引起国内外制药界的关注。研究认为 ，软胶囊溶出迟缓主要是由囊壳材料明胶产生交联反应所致。明胶的氧化及低分子醛类物质是导致交联反应的主要因素。明胶是由胶原蛋白水解而来的多肽片段，其分子中的氨基酸(主要是赖氨酸和精氨酸)所含有的侧链基团，在发生氧化或自氧化反应时形成醛基，促发交联反应，引起明胶结构中的胶原胶束发生变性，使软胶囊难以溶解，溶出时间明显延长。因此明胶的溶出度、平衡膨胀量和内容物含醛量可作为明胶交联反应的指标，而定量测定明胶中氨基酸的含量可以从分子水平反映明胶交联反应程度。本项目前期通过模拟明胶胶片，研究了环境因素和处方因素对明胶交联反应的影响 。考虑到软胶囊中药物成分的影响，尤其是许多中药提取物中含有醛基基团，很容易引发明胶的交联反应，本研究以中药银杏黄酮为模型药物制备软胶囊，考察温度、湿度、光线以及附加剂对囊壳交联反应的影响；采用甲醛处理胶囊壳模拟明胶交联，考察明胶平衡膨胀量、百分溶出量和氨基酸残基含量3种指标之间的相关性；研究软胶囊在加速实验条件下，明胶平衡膨胀量和氨基酸残基含量与崩解时间的相关性；采用差示热扫描法分析明胶结构的变化，探讨软胶囊溶出迟缓形成机理，以正确评价软胶囊质量，指导软胶囊剂的处方工艺设计和贮存条件选择。材料与方法仪器与试药 752型UV光栅分光光度计(上海分析仪器总厂)；ZRS-SG型智能溶出实验仪(天津大学无线电厂)；DSC20OPC型差示扫描量热仪(德国NETZSCH公司)。明胶(青海明胶股份有限公司)；聚乙二醇400(PEG400)(中国医药集团上海化学试剂公司)；Folin酚试液(北京欣经科生物技术公司)；三硝基苯磺酸(TNBS)溶液(5 ，Sigma公司)；甲醛原液(3732 ，中国上海化学试剂研究所)，银杏黄酮软胶囊(中国药科大学药物制剂研究所提供，主要成分为：银杏黄酮、明胶、甘油等)。明胶平衡膨胀量测定 明胶有限溶胀过程符合以下二级动力学方程式：式中：dsdt为某一时间的溶胀速率； 为溶胀速率常数；S。 为平衡膨胀量；S为膨胀率，其计算方法为其中Ws 为该胶片t时间时的重量；WI 为胶皮初始干重量。公式(1)积分并经数学简化后得：其中由公式(2)可知，Seq 的值可由tst直线的斜率B确定。将银杏黄酮软胶囊沿中缝切开，挤出内容物，用无水乙醇洗涤3次，室温下干燥至囊壳含水量10左右。取6粒囊壳分别标号，精密称重，置于蒸馏水500 mL中进行溶胀，于l，2，25，3，35和4 h取出囊壳擦干，精密称重。另取6粒于105烘干至恒重，求出胶囊壳初始干重，计算不同时间点囊壳的S值。按公式(2)回归计算Seq。明胶溶出实验 明胶含量测定采用Folin酚法 ，标准曲线方程为：A=0001 5C+0007 9(r=0999 2)，其中，C为明胶蛋白质的浓度。按上述方法将去除内容物、洗涤并干燥的银杏黄酮软胶囊壳进行溶出实验。溶出条件：37 ，100rmin-1，以蒸馏水为介质，30 min取样(为空白胶囊壳完全溶解的时间)。明胶氨基酸含量测定 按上述方法将去除内容物，洗涤并干燥的软胶囊壳粉碎，称取粉末l1mg浸入4 NaHCO3 l mL与05三硝基苯磺酸(TNBS)l mL的混合溶液中，40 保温4 h，然后加入6 molL-1 HC1 3 mL，于120 ，11 kPa下加热l h，所得溶液用水5 mL稀释，乙醚萃取3次。吸取水相5 mL，热水浴加热15 min，冷至室温，加水l5mL稀释后以空白溶液为对照于346 nm下测定吸收值A。空白溶液制备时需在加入TNBS溶液前加入HCl，其余步骤同前。所得吸收值按下式处理：- 氨基酸残基含量(Y)=mA其中，A为吸收度，m为公式简化常数，在光通路为l cm，样品重量为ll mg时其值为1830 210-4。甲醛对明胶平衡膨胀量、溶出速率及氨基酸含量的影响 配制质量浓度分别为0，275，368，459，55l，735和826 mgmL 甲醛溶液200mL，取空白软胶囊壳65粒分别于不同浓度甲醛溶液中浸泡15 min，取出擦干。按上述方法分别进行溶出、溶胀等实验，测定明胶平衡膨胀量、溶出百分率和氨基酸残基量，考察三者之间的相关性。温度、湿度和光线对交联反应的影响 按市售包装将银杏黄酮软胶囊在不同温度、湿度和光线条件下贮存3个月，定时取样，测定胶囊壳的Seq值。附加剂对明胶平衡膨胀量和崩解时间的影晌 在原软胶囊囊壳配方中加人不同附加剂制备软胶囊，在40，RH 75条件下放置3个月，定时取样，测定明胶胶壳的Seq值。根据上述附加剂对Seq值的影响，在银杏黄酮软胶囊囊壳处方中添加1焦亚硫酸钠，制成软胶囊。在40 ，RH 75条件下放置3个月，定时取样，测定软胶囊的崩解时限。明胶平衡膨胀量、氨基酸含量与崩解时间的相关性考察 将银杏黄酮软胶囊在40，RH 75条件下放置3个月，定时取样，分别测定软胶囊的崩解时间、明胶胶壳的Seq值和氨基酸残基量，考察相关性。差示热分析分别对空白胶囊壳、甲醛处理后的胶囊壳和40 ，RH 75条件下放置3个月的胶囊壳进行DSC测定，升温速度1 min-1，升温范围10-200 。结果1 甲醛对明胶平衡膨胀量、溶出速率及氨基酸含量的影响 甲醛处理囊壳的平衡膨胀量、氨基酸含量及百分溶出量测定结果见表1。Table 1 Swelling equilibrium quantity，dissolutionrate and amino group content of formaldehydecrossHnkedcapsule shells(n=8)从表1可见，随着甲醛浓度的增加，胶囊壳中明胶的平衡膨胀量、氨基酸含量与百分溶出量均下降。以平衡膨胀量对甲醛浓度进行回归，得方程：S =一166C+l997，r=0998 6；以溶出百分率(D)对甲醛浓度(C)进行回归，得方程：D =一l243c+1 150l，r=0991 2；以氨基酸含量(A)对甲醛浓度进行回归，得方程：A=一34210 C+34210一，r=0993 2；对平衡膨胀量(S )、溶出百分率和氨基酸残基含量测定结果进行相关性分析，结果为：D =745Seq - 3409， r=0995 3D =363105A一494 r=0998 5Seq = 486104A -393， r=0998 5上述结果表明，明胶在甲醛作用下发生交联后，其平衡膨胀量、溶出百分率和氨基酸残基含量之间均有良好线性关系。2 温度、湿度和光线的影响银杏黄酮软胶囊在不同温度、湿度和光线条件下贮存3个月，其胶囊壳的S 值见表2。由表2看出，在25(25 RH与75 RH)贮存的胶囊壳45 d后的S 与零时间相比有极显著性差异(P001)，而40=(25 RH与75 RH)或25见光贮存时，从15 d开始，胶囊壳的S 与零时间相比就有极显著性差异(P001)。样品放置90 d后，40 ，25 RH和75 RH条件下胶囊壳的S 值分别为零时间的4660和4319 ；光照条件(40 ，25 RH)下胶囊壳的S为零时间的5965 ，均显著低于25(25 RH或75 RH)条件下胶囊壳的S 值(为零时间的6567 )。在相同温度(25或40)条件下，不同湿度(25 RH与75 RH)对胶囊壳的S 值影响不大。3 附加剂的影响在空白囊壳(含明胶、甘油和水)中加人不同赋形剂制成软胶囊，在40，RH 75条件下放置3个月，测定胶囊壳中明胶的S 值，结果见表3。表3所列附加剂为软胶囊中常用的抗氧剂、增塑剂、表面活性剂、着色剂和避光剂及常用浓度。结果显示，加入这些附加剂的软胶囊在4O，75 RH放置3个月后，囊壳中明胶的Seq值有不同程度的变化，其大小依次为甘氨酸、焦亚硫酸钠、丙二醇、吐温-8O、二氧化钛、氧化铁、山梨醇。其中，丙二醇、吐温-8O(低浓度)与空白囊壳的5 。值相比有显著性差异(P005)，山梨醇、吐温-8O(高浓度)、氧化铁和二氧化钛与空白囊壳的Seq。值相比有极显著性差异(P001)。随着浓度升高，丙二醇、吐温-8O、氧化铁的Seq值有下降趋势，而二氧化钛、甘氨酸、焦亚硫酸钠的Seq值有上升趋势。甘氨酸和焦亚硫酸钠的的Seq值与空白囊壳相比变化很小。囊壳处方中加入1焦亚硫酸钠的银杏黄酮软胶囊，在4O ，RH 75条件下放置6个月，其崩解时限结果如图1所示。图l表明，未加附加剂的软胶囊在加速实验条件下，其崩解度随时间变化较大，6个月已超过2Orain(JPX II规定的标准崩解时限 )。加入l 焦亚硫酸钠的软胶囊，在同样条件下，崩解度随时间变化较小，二者数据相比有显著性差异(P005)。4 明胶平衡膨胀量、氨基酸含量及软胶囊崩解时间的相关性 银杏黄酮软胶囊在4O ，RH 75条件下放置3个月，其软胶囊的崩解时间、明胶胶壳的Seq值和氨基酸含量结果见表4。以平衡膨胀量对崩解时间进行回归，得方程：Seq =-0490 4B+1287，r=0986 3；以氨基酸含量对崩解时间进行回归，得方程：A=-0380 9B+2411，r=0994 9。可见明胶的平衡膨胀量和氨基酸含量与软胶囊崩解时间均呈良好线性关系。5 差示扫描热分析 空白胶囊壳、甲醛处理胶囊壳和加速放样(40 ，RH 75)3个月软胶囊囊壳的DSC测定结果如图2所示。讨论1 交联反应指标的相关性软胶囊崩解迟缓现象与囊壳主要成分 明胶的溶解性质发生改变有关。明胶是由多肽单链通过氢键相连形成的具有三维螺旋状空间结构的大分子：当明胶与水接触时发生溶胀，水分子插入链间，氢键的作用减弱，明胶分子向高弹态转变。溶胀后的明胶加热溶解时，三维螺旋状体系能量增高，明胶分子变成卷曲结构，由高弹态向溶液态转变，形成具有一定粘性的溶液。因此明胶能否发生溶解与能否实现螺旋卷曲转变密切相关 ：明胶蛋白分子中包含众多的氨基酸残基，其中，一氨基酸残基是明胶分子发生交联反应的主要位点之一? 一氨基酸残基是存在于赖氨酸上的一类胺类残基，其结构为RNH ，根据其结构和性质，其反应方程 为：RNH2+HCHO +RNH21 RNHCH2-NHR +H2O 可见1分子的甲醛可以使2分子的 氨基酸残基发生交联反应，因此在明胶分子内部会形成巨大的网状架桥结构。这种结构一旦形成，明胶的分子量显著增加，水溶性大大下降。表1结果证实，随着氨基酸残基含量的减少，明胶胶片的溶出量以及Seq相应降低。因此，明胶交联程度的大小与其水溶性密切相关，可通过明胶平衡膨胀量和溶出速度来衡量，也可以通过氨基酸残基的含量来显示。由于交联反应与醛类物质有关，本文采用甲醛处理模拟明胶交联反应 ，检验3种指标在反映交联程度中的变化规律，发现三者之间呈现良好的相关关系。3种方法中，溶胀动力学实验相对简便，误差较小，本文主要以此来考察明胶交联程度2 温度、湿度和光线的影响长期储存于高温下的明胶内部容易发生两种结构变化 。第一，明胶胶束的三维螺旋状结构被破坏，从而造成上述螺旋卷曲转变过程难以实现。第二，明胶分子中氨基酸残基易发生自氧化而形成醛基，形成的醛基可以和周围明胶分子上的氨基酸残基发生交联反应，最终形成分子内分子间相互联结的三维网状结构。当明胶分子结构发生变化后，其分子量显著增加，水溶性大幅下降 银杏黄酮软胶囊在40条件下储存后，平衡膨胀量降低，崩解时间明显延长，说明高温环境对交联反应有促进作用。高湿条件对于软胶囊的稳定性也有显著影响。在高湿度条件下，氧气更容易穿透明胶分子，从而加速对它的氧化作用。本实验中高湿条件对软胶囊壳的Seq影响并不显著，其原因有待进一步探讨。在光照条件下，软胶囊囊壳的平衡膨胀量显著降低，其原因是紫外线可以促进明胶自氧化，使明胶分子变性。3 附加剂的影响软胶囊中加入附加剂一方面可以保证囊壳成型和稳定，另一方面也可能影响明胶的交联。吐温一80是常用的表面活性剂，由于分子中含有聚氧乙烯基 ，在高温下易发生氧化降解，形成低分子醛类碎片，使明胶发生交联反应。丙二醇和山梨醇是常用的增塑剂，在高温、高湿条件下，显著降低软胶囊囊壳的Seq值，其原因可能是，这些增塑剂容易被氧化，形成一些低分子醛类杂质，从而增加明胶的交联程度，且随着用量的增加，这种现象更明显。氧化铁和二氧化钛是常用的遮光剂，虽然有避光作用，但在高温、高湿条件下又会引起囊壳Seq值的降低，这种现象与遮光剂降低明胶对醛类杂质的耐受能力有关。其中，前者的