微生物检验外界因素对细菌的影响.doc

第五章外界因素对细菌的影响本章考点：1.基本概念（1）消毒、灭菌、防腐、无菌、无菌操作2.物理因素对细菌的影响（1）高温（湿热、干热）（2）日光和紫外线（3）电离辐射（4）超声波（5）滤过除菌（6）干燥3.化学因素对细菌的影响（1）常用消毒剂的杀菌机制（2）常用消毒剂的种类4.影响消毒灭菌效果的因素及监测（1）影响因素（2）效果监测5.生物因素对细菌的影响（1）种类基本概念：1.消毒：消除或杀灭外环境中的病原微生物及其他有害微生物的过程称为消毒。用于消毒的化学药物称为消毒剂。2.灭菌：用物理或化学方法消除或杀灭物体上所有微生物（包括病原微生物、非病原微生物、细菌的繁殖体和芽胞）的方法。灭菌的要求是把微生物存活的概率减少到最低限度。3.防腐：防止和抑制细菌生长繁殖的方法。用于防腐的化学药物称为防腐剂。4.无菌：指物体上不含活菌。5.无菌操作：防止微生物进入机体或其他物品的操作技术称无菌操作。注：相似概念的区分，关键词的把握。一、物理因素对细菌的影响（一）温度各种细菌都需在最适生长温度的范围内生长。当外界温度明显高于最适生长温度，细菌被杀死；如果在低于细菌的最低生长温度时，细菌代谢活动受抑制，则出现抑菌作用。1.高温：细菌蛋白质、核酸、细胞壁和细胞膜及酶类因热力作用发生变性或凝固，活性消失，代谢发生障碍导致细菌死亡。大多数无芽胞细菌5560加热3060min即被杀死；加热100立即死亡，有芽胞的破伤风芽胞梭菌需煮沸3h才被杀死。热力灭菌分湿热和干热两种。在同一温度下，前者的效力大于后者。（1）湿热：常用的方法有 方法应用巴氏消毒法61.162.830min或 71.7l530s。目前主要用于牛乳消毒煮沸法煮沸l00（1个大气压状态下），5min中可杀死细菌繁殖体，如于水中加入2%碳酸钠，则可提高其沸点至105，可杀死芽胞。可杀死繁殖体和芽胞流通蒸气灭菌法利用一个大气压下l00水蒸气进行消毒。经1030min细菌繁殖体被杀死，但对芽胞的作用不大。间歇灭菌法间隔加热培养，使残存的芽胞发育成繁殖体，然后加热使之被杀死。可达到杀死芽胞又使不耐100的物质保存下来。高压蒸汽灭菌法通常在103.4kPa的压力下达121.3，维持1520min可杀灭所有细菌芽胞和繁殖体。可杀灭所有细菌芽胞和繁殖体。本法适用于耐高温、耐湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术敷料等。注：总结可杀死芽胞的方法有哪些？（2）干热1）烧灼：是常用的干热灭菌法。微生物实验室使用的接种环、接种针、瓶口和试管口常在火焰上烧灼灭菌。2）干烤：在密闭干烤箱内加温至160170维持2h是对一般玻璃器皿、注射器、瓷器的灭菌方法，适用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品。2.低温：一般细菌耐低温，在低温条件下，细菌代谢活动降低不再繁殖，能较长时间维持生命，故常用于保存菌种。为避免解冻时对细菌的损伤，可在低温状态下真空抽干，去尽水分，此法称冷冻真空干燥法，可保存细菌数年至数十年，是目前保存菌种的最好方法。（二）光线和射线随光线和射线的波长、强度、作用距离、持续时间而影响它们对细菌的作用。1.日光和紫外线：发挥杀菌作用的日光主要是紫外线，波长265266nm时杀菌作用最强。紫外线杀菌机制：紫外线使DNA分子形成胸腺嘧啶双聚体，干扰DNA正常复制，导致细菌死亡。紫外线可使分子氧变成臭氧，后者具有杀菌能力。杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼角膜等均有损伤作用，使用时应注意防护。紫外线穿透能力差。应用：手术室、微生物学实验室或不耐热的物品表面等。2.电离辐射：微生物体中的水受电离照射后产生的自由基及自由基离子破坏微生物核酸、酶和蛋白质致微生物死亡，适用于不耐热物品的灭菌。如X线、射线、高速电子等。应用：不耐热的塑料制品。（三）超声与超声波不被人耳感受的高于20千赫兹秒的声波称超声波。杀菌机制是超声波通过液体时发生的空腔化作用破坏了原生质的胶体状态，导致细菌死亡。应用：一般用于细胞的粉碎以提取细胞组分和抗原制备。（四）滤过除菌滤过是以物理阻留方法将液体或空气中的微生物除去。所用的器具为滤器。滤器中的微孔只允许液体或气体中小于滤孔孔径的物质通过。滤器的种类很多，目前常用的有薄膜滤器。用于除菌的滤膜孔径为0.22m。另外以石棉板为滤板的金属滤器称Seitz滤器（蔡氏滤器），按其滤孔大小分成三种：K型滤孔最大，澄清用；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过；EK滤孔居中，用以去除一般细菌。全由玻璃制成的玻璃滤器分成G1G6六种。G5、G6两型能阻止细菌通过。应用：适用于不耐热，也不能用化学方法消毒的液体或空气。（五）干燥许多细菌的繁殖体在空气中干燥时可以死亡。干燥引起细菌脱水、蛋白质变性和盐类浓缩，因而妨碍细菌的代谢、生长、繁殖而引起细菌死亡。食物经晒干、烘干、风干等干燥后，水分减少，不适于细菌等繁殖，因而可延长食物的保存时间，起到防腐作用。二、化学因素对细菌的影响（一）常用消毒剂的杀菌机制1.使菌体蛋白变性或沉淀，如酚类（高浓度）、醇类、重金属盐类（高浓度）、酸碱类、醛类等。2.干扰微生物酶系统和影响其代谢活动，如氧化剂、低浓度重金属盐类使-SH基氧化成-S-S-，致以-SH为活性基的酶丧失活性。3.损伤细胞膜，如酚类（低浓度）、表面活性剂等。（二）常用的消毒剂的种类1.氧化剂：常用的有过氧化氢、过氧乙酸、高锰酸钾等。2.酚类：常用石炭酸、来苏、六氯酚等。3.烷化剂：包括环氧乙烷、乙型丙内脂、环氧丙烷、溴化甲烷等。4.表面活性剂：常见的有新洁尔灭、消毒净、杜灭芬等。5.其他：有醇类、醛类、卤素及其化合物、重金属盐、染料及酸碱类。三、影响消毒灭菌效果的因素及监测（一）影响因素1.消毒剂的性质、浓度和作用时间。一般浓度越高杀菌作用越强，时间越长，消毒效果越好。2.微生物的种类和数量。3.温度和酸碱度：升高温度可提高消毒剂的效果。pH对消毒的效果影响很大，各种不同消毒剂所需最适pH与消毒剂性质有关。4.环境中的有机物及拮抗物质：物体表面或环境中的有机物与化学消毒剂的活性基团结合减弱其杀菌能力。5.湿度、穿透力、表面张力等。（二）消毒灭菌效果的检测各种理化因素对细菌消毒灭菌的效果常需用某些指标加以监测。常用生物指标监测压力灭菌器和紫外线的灭菌效果。高压蒸汽灭菌效果监测用嗜热脂肪芽胞杆菌（ATCC7953）；紫外线杀菌效果监测则用枯草芽胞杆菌黑色变种（ATCC9372）。四、生物因素对细菌的影响种类：噬菌体：是感染细菌、真菌等微生物的病毒因为能使细菌裂解，故称为噬菌体；抗生素：是由真菌、放线菌或细菌等微生物产生的能杀灭或抑制病原微生物的物质；细菌素：是某些细菌产生的，只对产生菌亲缘关系相近的细菌有抗菌作用的一类蛋白质。本章练习题：滤过除菌所用的薄膜滤器滤膜孔径大小为A.0.21mB.0.22mC.0.23mD.0.24mE.0.25m答疑编号500735050101正确答案B消毒是指A.杀灭物体上所有微生物B.杀灭物体上的病原微生物C.杀灭细菌芽胞D.使物体上无活菌存在E抑制微生物生长繁殖的方法答疑编号500735050102正确答案B 杀灭芽胞最常用和最有效的方法是A.煮沸5分钟B.巴氏消毒法C.流通蒸汽灭菌法D.高压蒸汽灭菌法E.紫外线照射答疑编号500735050103正确答案D 常用消毒剂的杀菌机制包括A.使菌体蛋白变性或沉淀B.干扰微生物酶系统和影响其代谢活动C.损伤细胞膜D.干扰DNA合成E.破坏细胞壁的结构答疑编号500735050104正确答案ABC 影响消毒灭菌效果的因素有A.消毒剂的性质、浓度和作用时间B.微生物的种类和数量C.温度和酸碱度D.环境中的有机物及拮抗物质E.湿度答疑编号500735050105正确答案ABCDE第六章细菌的遗传与变异本章考点：1.遗传变异的物质基础（1）微生物遗传物质组成结构特点（2）细菌染色体（3）细菌质粒（4）细菌转位因子2.微生物变异的现象（1）概念与分类（2）形态与结构变异（3）培养特性变异（4）毒力变异（5）耐药性变异3.微生物变异的机制（1）概念（2）突变（3）基因物质的转移与重组（4）病毒基因的相互作用4.遗传变异研究的实际意义（1）在临床疾病诊断和治疗中的意义（2）在细菌和疫苗研究中的意义一、概述遗传使微生物的性状保持其种属的稳定性，变异是微生物进化的基础。二、遗传变异的物质基础（一）遗传物质组成结构特点微生物的遗传物质是DNA。细菌遗传的物质基础存在于染色体、质粒和转位因子中。（二）细菌染色体1.细菌染色体特点为：一环状双螺旋DNA长链。细菌的基因结构呈连续性、无内含子（与其他生物细胞的染色体相区别），因此，转录后的DNA不需加工剪切即可产生成熟的mRNA。2.细菌DNA复制和表达：大多数细菌的基因组中只有一个起始点顺序，复制时成团的DNA解开成环状，然后按DNA复制半不连续模式进行复制：即35链（先导链）复制的新生链是连续的，而与先导链互补的53链（随从链）复制的DNA是不连续的，以53方向先合成冈崎片段，再通过DNA连接酶共价连接成完整的一条链。由DNA经过RNA到多肽链的过程，即基因表达的过程。目前研究表明调控部位、调节蛋白和效应物分子是影响基因表达的主要调节因素。（三）细菌质粒1.质粒：是细菌体内染色体外的环状双股DNA，有时也可呈线状或超螺旋状。2.质粒的基本特性：质粒DNA的复制为不依赖细菌染色体而自主复制；不相容性，两种结构相似，密切相关的质粒不能稳定的存在于一个菌细胞；转移性；指令宿主菌编码某些特殊功能蛋白质而赋于宿主菌众多的生物学特性。3.质粒分类：按质粒编码的生物学性状一些重要的质粒有：种类作用F质粒（致育质粒或致育因子）可编码性菌毛R质粒（耐药性质粒）编码细菌对抗菌药物的耐药性Vi质粒（毒力质粒）编码与细菌致病性有关的毒力因子细菌素质粒（如Col质粒）编码大肠埃希菌产生大肠菌素4.耐药性质粒的分类及其特征：（四）细菌转位因子1.转位因子：为存在于细菌染色体或质粒上的一段特异的核苷酸序列重复，它可在DNA分子中移动，不断改变它们在基因组内的位置，从一个基因组移动到另一个基因组中。2.分类及特点：转位因子主要有三类：插入序列、转座子、转座噬菌体。插入序列由两末端为反向重复顺序和转座有关的基因组成，不携带其他任何已知和插入功能无关的基因区域，是最小的转位因子。转座子除携带与转位有关的基因外，还携带一些结构基因，能整合到受体DNA的多个“热点”上。转座噬菌体是一些具有转座功能的溶原性噬菌体。三、微生物变异的现象微生物变异现象可见于微生物的各种性状，表现为形态、结构、菌落、抗原性、毒力、酶活性、耐药性、空斑、宿主范围等的变异。可分为非遗传型变异和遗传型变异。微生物在一定的环境条件下发生的变异，不能稳定地传给子代，当环境条件改变，可能恢复原来性状，称为非遗传型变异；微生物的基因型发生改变，变异的性状能稳定地传给子代，并且不可逆转，称为遗传型变异。变异现象举例形态变异结构变异特殊结构的变异菌落变异毒力变异耐药性变异细菌对某种抗菌从敏感到耐药的变异酶活性变异等四、微生物变异的机制微生物变异分遗传型变异和非遗传型变异，后一类型的变异在细菌中颇为常见。引起遗传型变异的机制包括微生物遗传物质的突变及基因的转移和重组。（一）突变突变是细菌遗传物质结构发生突然而稳定的改变，这种改变可传于后代。在细菌生长繁殖过程中突变经常发生。根据细菌种类不同其突变率差别很大。突变率是由复制的准确度、DNA损伤的发生机会及对损伤DNA修复程度三方面综合决定。一般在l06109中发生一次。1.基因突变的规律（1）自发突变和诱导：每个细菌都可自发突变，但频率很低。当加入诱导剂（紫外线、X线、烷化剂、亚硝酸盐等）后可使突变率提高l01000倍。（2）随机突变和选择：突变是随机和不定向的，Luria与Delbruck所做的彷徨实验和Lederberg设计的影印实验证实。（3）突变和回复突变：某种细菌在自然环境下大多数所具有的表型菌株称为野生型菌株，发生突变后的菌株则称为突变型株。经过再次突变又可成为与野生型相同表型的过程称为回复突变。2.突变的类型和机制：按DNA分子碱基对的变化可分碱基的置换、碱基的插入和缺失，以及转位因子的插入。（1）碱基的置换：在DNA链上一个或几个碱基可以发生置换。置换可以是一个嘌呤碱置换另一个嘌呤碱（A+G）或一个嘧啶碱置换另一个嘧啶碱（T+C），称为置换；当以嘌呤置换嘧啶或反之则称颠换。碱基的突变影响到密码的组成，改变所编码的氨基酸而影响蛋白质功能。（2）碱基的插入和缺失：当核苷酸序列上插入或缺失一个碱基，则使插入或缺失部位以后的序列中的碱基发生移码突变。（3）转位因子的插入：DNA链上大段核苷酸序列的插入、缺失可导致大的突变。（二）基因物质的转移和重组1.转化：是受体菌直接摄取供体菌提供的游离DNA片段整合重组，使受体菌的性状发生变异的过程。基因的转化需要一定的条件：细菌在摄取外源性DNA时需处于感受状态；细菌的种类与能否摄入外源性的DNA有关，除链球菌属、嗜血杆菌属及芽胞梭菌属外，大多数细菌不能自然摄入外源性DNA。革兰阳性菌和革兰阴性菌的转化方式不同。革兰阳性菌的感受态是由称为感受态因子（CF）的胞外信号诱导的，菌细胞上的特异受体和CF结合诱导新的蛋白质产生参与转化。革兰阴性菌的感受态产生不需CF诱导，必须是亲缘关系近的细菌DNA才能和受体菌整合。2.转导：是以噬菌体为媒介，将供体菌的基因转移到受体菌内，导致受体菌基因改变的过程。分为普遍性转导和局限性转导。在偶然条件下，细菌的DNA片段或小质粒可被错误的包装在噬菌体头部，成为一个转导性噬菌体。由于这种错误包装是随机的，可将细菌染色体任何部位基因包装入噬菌体头部，因而这种噬菌体引起的转导称普遍性转导。 噬菌体DNA脱离宿主染色体时发生偏差，把自身一段DNA留在染色体上，而将细菌染色体上原整合部位两侧的基因带走。此错位切割的噬菌体是缺陷型噬菌体，这种只转导噬菌体整合位置相邻的个别特定基因的转导称为局限性转导。 3.接合：是受体菌和供体菌直接接触，供体菌通过性菌毛将所带有的F质粒或类似遗传物质转移至受体菌的过程。主要见于革兰阴性菌。带有F质粒的细菌可形成性菌毛，称F+（雄菌），无F质粒的细菌无性菌毛，称F-（雌菌）。F质粒的接合分三种类型：F+与F-接合，使F-转变为F+，原来的F+仍为F+。这一过程仅涉及F质粒的传递，不涉及细菌染色体的转移。Hfr（高频重组菌）与F-接合，使F-获得供菌染色体的部分DNA片段，而F质粒几乎不可能进入受体菌。F质粒与F-接合，F质粒是从染色体上脱离下来带有细菌染色体上邻近基因的质粒，此过程使F-转变为F+，同时获得供菌染色体部分DNA片段。革兰阳性菌依赖CIA（聚集诱导因子）诱导的质粒接合方式。4.溶原性转换：是噬菌体的DNA与细菌染色体重组，使宿主菌遗传结构发生改变而引起的遗传型变异。溶原性细菌因此而获得新的特性。5.原生质体融合：两种经过处理失去细胞壁的原生质体混和可发生融合，融合后的双倍体细胞可发生细菌染色体间的重组。（三）病毒基因的相互作用1.基因重组：当两种或两种以上亲缘关系相近的病毒即同属不同种病毒感染同一细胞时，它们的基因组可相互作用发生基因重组。重组可使基因再激活，表现为交叉复活和多重复活两种形式。当一种有感染性的病毒和另一种有亲缘关系的灭活病毒同时感染细胞时，经基因重组产生具有灭活病毒亲代的一种或多种遗传特征的重组体，此现象称为交叉复活。常用于流感病毒疫苗株的制备。两种或两种以上的同种灭活病毒，感染同一细胞，若受损基因在两个亲代的不同部分，经过基因重组而复活，产生感染性的病毒，此现象称为多重复活。2.互补作用和表型混合（1）互补作用：是一种病毒为另一种病毒提供本身不能合成但又是必需的基因产物，使其在混合感染的细胞中得以增殖。包括：有活力的病毒和缺损病毒混合感染细胞；有活力的病毒和只损伤衣壳而未损伤基因的灭活病毒共同感染细胞；两种缺损病毒混合感染细胞。（2）表型混合：是互补作用的特殊例子，产生的子代包括：与亲代相同的病毒；病毒含一个亲代的基因组和另一个亲代的衣壳；病毒具有两种病毒成分的衣壳。五、遗传变异研究的实际意义（一）在临床疾病诊断和治疗中的意义在临床微生物学工作中，经常会遇到一些不典型的细菌，要作出正确的诊断，不但要熟悉其典型特性，还要了解细菌发生的形态、菌落、生化、毒力、抗原性等各种性状变异。充分了解微生物变异现象和规律才能避免误诊和漏诊的发生。在疾病治疗方面，抗生素的广泛使用使临床分离的耐药菌株日益增多，所以在选用治疗药物时应先做抗菌药物的敏感试验，选择敏感药物。防