分光光度法测定川牛膝中多糖含量_刘友平.pdf

1997 年 12 月第 20卷第 4期 Dec 1997 Vol 20 No 4 成都中医药大学学报 Journal of Chengdu University of T CM 49 中 药 研 究 分光光度法测定川牛膝中多糖含量 刘友平 李祖伦 陈红 马逾英 张廷模 摘要 采用分光光度法 经苯酚 硫酸显色 于 490nm 波长处对川牛膝中多糖的含 量进行了测定 并对影响显色反应的主要因素进行了考查 该方法简便 快速 准确 灵 敏度高 可作为川牛膝质量控制标准 关键词 川牛膝 多糖 分光光度法 含量测定 中图分类号 R941 41 成都中医药大学 成都 610075 收稿日期 1997 05 14 四川省中医管理局科研基金资助课题 川牛膝 为苋科植物川牛膝 Cyathula officinalis Kuan 的干燥根 具有逐瘀通经 通利关节 利尿通淋之功效 1 为著名的川产 道地药材 关于川牛膝多糖的化学及药理作 用研究 尚未见文献报道 为填补这一空白 我们对川牛膝多糖进行了较为系统的研究 结果表明其具有免疫促进作用 能显著增强 网状内皮系统吞噬功能 增强NK 细胞活性 增强 SRbc 致敏小鼠的 PFC 反应能力 还具 有显著促进红细胞免疫粘附性和加强红细胞 对循环免疫复合物的清除等药理作用 故川 牛膝多糖为川牛膝中重要的有效成分之一 其化学组成及结构研究工作正在进行 现将 采用苯酚 硫酸分光光度法 2 对川牛膝中多 糖含量进行测定的结果报告如下 1 材料和仪器 1 1 药材 川牛膝 购自四川省天全县药材 公司 经本校马逾英讲师鉴定为苋科植物川 牛膝Cyathula officinalis Kuan 的干燥根 1 2 试药和仪器 葡萄糖标准品 AR 105 干燥至恒重 苯酚试剂 取苯酚 150g 铝片 0 2g 碳酸氢钠 1 0g 混合 沙浴蒸馏 收集 180 182 的馏分 称取此馏分 12 5g 置 250ml 容量瓶中 加蒸馏水至刻度 摇匀 避光 冷藏 751 GW 型分光光度计 上海 分析仪器厂 2 方法与结果 2 1 多糖的提取与精制 称取川牛膝粗粉 50g 于索氏提取器中 依次以石油醚 250ml 乙醚 250ml 80 乙醇 250ml 分别提取 12h 残渣挥干溶剂后 用水 500ml 回流提取 4h 滤液减压浓缩至 100ml 浓缩液用 Sevage 法 反复处理多次以除去蛋白质 用乙醇调含醇 量至 80 静置过夜 滤过 沉淀以 95 乙 醇 丙酮反复抽洗多次 真空干燥即得川牛 膝精制多糖 2 2 最大吸收波长的选择 精密称取 105 干燥至恒重的葡萄糖 24 76mg 定容至 100ml 容量瓶中 加蒸馏水至刻度 混匀 精密吸取该 溶液0 5ml 加水1 5ml 加入5 苯酚溶液1 0ml 浓硫酸 5 0ml 室温放置 15min 然后置 100 恒温水浴中加热15min 取出 冷水中冷 却至室温 以蒸馏水 2 0ml 同上法作空白对 照 于380 580nm 范围内测定吸收度 其最 综上结果可知 显色反应最佳条件为 苯 酚试剂 1 2ml 浓硫酸 5 5ml 加酸后放置 15min 水浴温度 25 2 4 标准曲线的制备 精密称取葡萄糖 31 2mg 以蒸馏水定容至 250ml 容量瓶中 摇匀 精密吸取该溶液 5 0ml 10 0ml 15 0ml 20 0ml 25 0ml 于 50ml 容量瓶中 用 蒸馏水定容 摇匀 精密吸取上述各浓度葡萄 糖溶液 2 0ml 于具塞试管中 分别加入苯酚 试 剂 1 2ml 浓 硫 酸 5 5ml 混 匀 放 置 15min 再置 25 水浴中放置 15min 取出 另以蒸馏水 2 0ml 加入苯酚试剂和浓硫酸 同上操作 于 490nm 处测定吸收度 以吸收 度为纵座标 葡萄糖浓度为横座标 作回归处 理得回归方程为 A 67 72 1 9 10 3 0 9997 葡萄糖浓度在 3 3930 16 9560 g ml 范围内 与吸收度呈良好的线性关 系 2 5 换算因素测定 精密称取精制多糖 47 5mg 用水溶解置 250ml 容量瓶中 用蒸 馏水稀释至刻度 摇匀 作贮备液 精密吸取 多糖贮备液 0 5ml 加水 1 5ml 按 2 4 标准 曲线项下自加入 苯酚试剂 1 2ml 起 测定 吸收度 从回归方程求出供试液中葡萄糖浓 度 按下式计算换算因素 f W CD 其中 W 为多糖重量 mg C 为多糖液中葡萄糖浓 度 D 为多糖的稀释因素 测得 f 1 2968 2 6 样品测定 精密称取样品 1 0g 置索 氏提取器中以80 乙醇提取 6h 药渣挥尽乙 醇 连同滤纸置于烧瓶中 加蒸馏水 150ml 加热提取 1h 趁热过滤 残渣用热水洗涤 10ml 3 洗液与滤液合并 冷却后移入 250ml 容量瓶 定容 精密吸取该溶液 1 0ml 于 50ml 容量瓶中 定容 作供试液 精密吸 取供试液 2 0ml 按 2 4 标准曲线项下自加 入 苯酚试剂 1 2ml 起测定吸收度 按回归 方程求出供试液中葡萄糖含量 按下式计算 多糖含量 多糖含量 C D f W 100 其中 C 为供试液的葡萄糖浓度 mg ml D 为供试液的稀释因素 f 为换算因素 W 为供 试品重量 mg 测定结果为川牛膝中多糖含 量为 50 51 RSD 1 55 n 5 2 7 稳定性试验 取供试液 每隔一定时间 测定吸收度 结果在显色2h 内吸收度值无变 化 2 8 回收率测定 精密称取川牛 膝样品 1 0g 加入一定量川牛膝多糖 按 2 3 试 液 制备和 含量测定项下操作 计算回 收率 为99 13 3 讨论 3 1 本实验原理为多糖在浓硫酸的作用下 水解生成单糖 并迅速脱水成酉 康醛 然后与 苯酚缩合生成有色化合物 用分光光度法测 定其含量 本法简单快速 灵敏度高 显色稳 定 重现性好 3 2 本实验首先采用 80 乙醇处理样品 消除了亲脂性杂质 单糖 低聚糖及甙类等成 分的干扰 结果可靠 3 3 植物多糖作为免疫增强剂已引起人们 的广泛关注 3 临床用于肿瘤病人的治疗已 取得较好疗效 川牛膝多糖可否作为免疫增 强药物应作进一步深入研究 3 4 本研究结果在评价川牛膝内在质量及 资源开发利用方面具有一定价值 参考文献 1 中华人民共和国药典委员会 中华人民共和 国药典 一九九五年版 一部 广东科技出版社 化学科技出版社 1995 27 2 Dubois M Anal Chem 1956 28 350 3 周金黄 中药药理与临床研究进展 北京 军 事医学科学出版社 1995 41 51 第 4 期刘友平等 分光光度法测定川牛膝中多糖含量 大吸收波长为490nm 2 3 实验条件的选择 葡萄糖供试液的配 制 精密称取葡萄糖 30 2mg 置250ml 容量 瓶中 加蒸馏水至刻度 作贮备液 精密吸取 该贮备液 10 0ml 于 50ml 容量瓶中 以蒸馏 水定容 作供试液 浓度为 12 08 g ml 2 3 1 苯酚试剂用量选择 精密吸取上述 供试液 2 0ml 苯酚试剂用量为 0 4 2 2ml 加入浓硫酸 6 0ml 加酸后放置 15min 置 25 水浴中恒温 15min 于 490nm 处测定 吸收度 结果见表 1 苯酚用量为 1 2ml 以上 时吸收度值趋于稳定 表 1 不同用量苯酚试剂的显色结果 苯酚用量 ml 0 40 60 81 01 21 41 61 82 02 2 吸 收 度 0 2910 3030 3170 3180 3250 3250 3240 3260 3230 324 2 3 2 浓硫酸用量 选择 加入苯酚试剂 1 2ml 浓硫酸用量为 3 5 7 0ml 其余操作 同 2 3 1 测定吸收度 结果见表 2 浓硫酸用 量为 5 5ml 以上时吸收度值趋于稳定 表 2 不同用量硫酸的显色结果 浓硫酸用量 ml 3 54 04 55 05 56 06 57 0 吸收度 0 1580 2340 2940 3390 3440 3440 3420 340 2 3 3 浓 硫酸 加入 后放置 时间 选择 取供试液 2 0ml 加入苯酚试剂 1 2ml 浓硫 酸 5 5ml 放置不同时间测定吸收度 结果见 表 3 加酸后放置 15min 吸收度值趋于稳定 在 2h 内吸收度值变化较小 表 3 加酸后放置时间与吸收度 放置时间 min 5101520253060120 吸 收 度 0 2760 3120 3360 3340 3360 3320 3300 334 2 3 4