biochemistry e6 翻译 第9章催化机制.doc

第9章 催化机制国际象棋和酶都使用策略，国际象棋通过比赛来发展策略，而酶是通过进化来建立酶促反应机制。右边是能够酶切肽键的活性位点，由三个氨基酸残基（化学键是白色）构成。用黑色化学键表示的底物分子如同左边象棋比赛中已经落入圈套的国王，面临被裂解的命运。酶催化效率和特异性的基础是什么？本章介绍四类酶促反应的机制，包括丝氨酸蛋白酶、碳酸脱水酶、限制性核酸内切酶、和核苷单磷酸激酶。前三类酶催化的化学反应将水分子加成到底物分子上，第四类酶要避免水分子的加成。经过大量的实验研究（包括蛋白质结构测定、定点突变），这些酶的催化机制已经清楚。这些酶的催化机制阐述了很多重要的催化原理。我们将看到，酶采用结合能、诱导匹配、和一些特殊的催化策略，协助底物形成转化态。每类酶采用的机制就是要解决各种化学反应所面临的问题。丝氨酸蛋白酶的例子是胰凝乳蛋白酶，就是要将缺乏催化剂和pH 7.0几乎不发生的反应(蛋白质水解）进行下去。碳酸脱水酶需要将化学反应加速到能够与其他快速生理过程融合的水平。而限制性内切酶如EcoRV要解决的问题是实现酶切反应的高度特异性。最后一类酶如NMP激酶，要解决的问题是在转移磷酸的过程中，磷酸基团从ATP转移给另一个核苷酸（而不会转移到水分子）。选来讲解的酶是各自酶家族的代表性成员。酶家族成员之间比较揭示如何进化产生、如何优化酶活性位点。酶作用的结构和酶促机理比较能够了解酶的进化史。此外，催化机制知识有实际应用价值，包括开发特异性强的有效抑制剂用作药物。最后，虽然我们没有特别介绍催化RNA分子，但是蛋白质酶所采用的催化原则同样适用于RNA催化剂。很多酶采用的几个基本的催化原则在第8章我们知道底物与酶结合启动催化。结合能是酶和底物之间形成大量弱相互作用所释放的自由能。这种结合能既可建立底物特异性，又能增加酶促效率。只有正确的底物才能与酶形成大多数甚至全部酶-底物相互作用，使结合能最大化。这点能够解释很多酶的底物特异性。而且，当底物转化成转化态，底物与酶之间完全互补。因此酶和底物之间的相互作用稳定转化态，从而降低反应的活化自由能。结合能对酶分子和底物的结构变化都有促进作用，使它们相互间匹配度更高（诱导匹配），有助于催化反应。酶通常采用下列一种或几种策略催化特定化学反应。1. 共价催化。共价催化的活性位点有活泼基团，通常是很强的亲核基团。在酶促过程中亲核基团能暂时性共价连接底物。胰凝乳蛋白酶就采用这种策略。2. 酸碱催化。酸碱催化中，水分子之外的物质提供质子或接受质子。胰凝乳蛋白酶使用一个组氨酸残基作为碱催化剂（接受质子），促进丝氨酸的亲核攻击能力。而碳酸脱水酶的一个组氨酸残基有助于Zn2+-H2O复合物丢失一个质子，产生OH-离子。3. 接近催化。很多酶有两个不同的底物。此时将两种底物置于一个酶分子的同一结合面能显著增加反应速度。NMP激酶将两种核苷酸放置在一块有助于磷酸基团从一个核苷酸转移到另一核苷酸。4. 金属离子催化。金属离子起催化作用的方式有几种。例如金属离子的配位作用产生OH-离子是亲核试剂。碳酸脱水酶的Zn2+就是起这种作用。此外金属离子本身是亲电试剂，稳定带负电荷的中间体。EcoRV的Mg2+所起的作用就是稳定中间体。最后金属离子也可以作为底物与酶结合的桥梁，增加结合能、将底物置于酶分子合适位置适于催化。NMP激酶以及几乎所有利用ATP作为底物的酶，其金属离子是底物和酶结合的桥梁，负责将底物分子置于酶分子合适位置。9.1 蛋白酶能促进非常难于发生的反应生物体内蛋白质转换是一个重要过程（第23章）。已经完成自身任务的蛋白质必须降解，产生的氨基酸能够被回收作为新蛋白质合成的原料。进食获得的蛋白质要消化成氨基酸才能被肠道吸收。另外蛋白质裂解对一些酶和蛋白质活性的调节非常重要。蛋白酶裂解蛋白质是对蛋白质进行水解，即将水分子加成到一个肽键上：尽管肽键的水解在热力学上是有利的，但是这种水解反应非常缓慢。没有催化剂，肽键水解的半衰期（在中性pH值）估计是10 1000年。但是在有些生化过程中，肽键的水解必需在毫秒内完成。肽键的化学键能与其动力学稳定性有关。肽键的共振结构说明肽键是平面结构，这种结构对水解有抗性。肽键的共振结构使肽键具有部分双键的特征：由于C-N键具有双键特征，两个原子之间结合力进一步加强。羰基碳原子对亲电攻击的敏感性降低，对亲核攻击的敏感性降低（与其他物质如羧酸酯的羰基碳原子相比）。因此，为了促进肽键裂解，酶能促进亲核基团对肽键碳原子的亲和攻击（正常情况下肽键的羰基碳原子不活泼）。胰凝乳蛋白酶具有高度活泼的丝氨酸一些蛋白酶参与哺乳动物和其他生物消化道的蛋白质水解。胰凝乳蛋白酶就是一种这样的蛋白酶，它能选择性断裂大的疏水氨基酸（如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸）C-端肽键（图9.1）。胰凝乳蛋白酶是共价催化的例子。酶利用强亲核基团攻击底物不活泼羰基碳原子。在催化过程中，亲核基团与底物暂时性共价交联。那么，攻击底物羰基的亲核试剂是什么？胰凝乳蛋白酶有一个活泼的丝氨酸残基，用DIPF处理使胰凝乳蛋白酶活性不可逆丧失（图9.2）。DIPF处理只修饰195位丝氨酸。该化学修饰提示这个活泼的丝氨酸在胰凝乳蛋白酶催化过程中起关键作用。图9.1 胰凝乳蛋白酶的特异性。胰凝乳蛋白酶裂解芳香氨基酸或大的疏水氨基酸（已经用桔色涂出）C-端肽键（用红色标出）。图9.2 胰凝乳蛋白酶有一个很活泼的丝氨酸。用DIPF处理，胰凝乳蛋白酶分子28个丝氨酸残基中195位丝氨酸与DIPF反应，导致胰凝乳蛋白酶失活。经过两步共价连接的中间物，胰凝乳蛋白酶催化蛋白质裂解酶促动力学研究给胰凝乳蛋白酶促反应机制提供了另一个线索。用那些产物有颜色的底物类似物易于进行酶动力学检测。例如，胰凝乳蛋白酶动力学检测的颜色底物是N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯。这个物质是酯（不是酰胺键），但是很多蛋白酶能够水解酯，产生黄色化合物对硝基苯酚（图9.3）。光吸收数值能够测定对硝基苯酚的产量。图9.3 颜色底物。胰凝乳蛋白酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯产生黄色产物对硝基苯酚。在pH7.0，对硝基苯酚解离。在稳态条件下，胰凝乳蛋白酶对这个底物的裂解遵循米氏动力学，Km是20 mM，kcat是77 s-1。停留法(stopped-flow method)检测反应的起始状态，能够在毫秒范围内混合酶和底物、跟踪毫秒时间内的反应结果。结果显示起始状态迅速形成一种颜色产物，随后缓慢（即进入稳态）（图9.4）。这些结果提示，酶促反应过程有两个步骤，第一步很快，第二步很慢。图9.4 胰凝乳蛋白酶催化的动力学。胰凝乳蛋白酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯有两个阶段：快速（稳态前）阶段和稳态阶段。胰凝乳蛋白酶促水解反应的两个步骤涉及酶与底物的共价结合（图9.5）。第一步，底物的酰基与酶共价结合，同时释放对硝基苯酚或胺类（如果底物是酰胺键）。酶-酰基复合物称为酰化酶中间物。第二步，酰化酶中间物水解，释放底物的羧酸组分和游离酶。因此，酶酰化并释放对硝基苯酚的速度很快，但是水解酰化酶“恢复”游离酶的速度很慢。而这两个步骤都是酶促反应必需的。图9.5 共价催化。胰凝乳蛋白酶水解有两个阶段：（A）酰化形成酰化-酶中间体；随后(B)去酰化释放游离酶。丝氨酸是三残基（包括天冬氨酸和组氨酸）构成的活性中心的一部分1967年David Blow解析了胰凝乳蛋白酶的三维结构。初看上去，胰凝乳蛋白酶是球状，由二硫键连接在一起的三条多肽链构成。合成的时候是一条多肽链，称为胰凝乳蛋白酶原。酶原活化是蛋白酶裂解这个蛋白酶原，生成三条多肽链。酶促活性位点有Ser 195，位于酶表面的裂缝中（图9.6）。活性位点的结构说明Ser 195特别活泼（图9.7）。Ser 195的侧链与His 57的咪唑环形成氢键。咪唑环的NH又与Asp 102形成氢键。活性位点氨基酸残基这样的排布称为催化三体。这种排布如何使Ser 195特别活泼？组氨酸残基定位Ser残基侧链，极化Ser侧链的羟基（去质子）。底物存在时，His 57侧链接受Ser 195侧链羟基的质子，因此His 57是碱催化剂。Ser 195丢失氢离子，产生烷基氧离子。烷基氧离子的亲核性比羟基大得多。Asp 102协助His57定位，通过氢键和静电相互作用使His 57更能接受Ser 195的质子。图9.6 胰凝乳蛋白酶催化活性位点的位置。胰凝乳蛋白酶有三条多肽链，分别用橘色、蓝色、和绿色骨架表示。活性中心的三个氨基酸残基用球棒模型表示。注意这些侧链，包括Ser 195, 其排列位置处于蛋白分子上半部分。整个分子的不同位置还有两个链内二硫键和两个链间二硫键。图9.7催化三联体。左边是催化三联体，能够将Ser 195转化成强亲核试剂（右边）。这些观察提示胰凝乳蛋白酶的一种肽水解的机制（图9.8）。第一步底物与酶结合。然后酶分子的Ser 195的氧原子亲核攻击目标肽键的羰基碳原子（第2步），产生四个原子与羰基碳原子结合（从平面结构转化成四面体结构）。羰基碳原子的四面体结构不稳定（因为羰基原来的氧原子带有负电荷），但是氧负离子与酶蛋白的氧负离子洞的NH基团（图9.9）相互作用稳定，从而稳定羰基碳原子四面体（转化态）。第三步，四面体崩溃产生酰化酶。这一步的促进因素是His57的正电荷侧链给要断裂肽键的氨基提供质子。第四步，断裂肽键的氨基成分离开酶，完成水解反应的第一阶段反应（酶的酰化）。第二阶段是酶的脱酰反应。水分子占据先前底物氨基成分所在的位置（第5步）。酰化酶酯键的水解反应基本上是重复第2至第4步。作为碱催化剂，His 57的咪唑环吸收水分子的质子，产生的OH-离子攻击酰基的碳原子，形成四面体碳原子（第6步）。断裂形成羧基（这一步倒是His 57作为酸催化剂（第7步）。最后，释放羧酸产物（第8步），可以进行下一轮反应。图9.8 胰凝乳蛋白酶水解肽键的催化反应。肽水解可以解释共价催化和酸碱催化机制。反应过程包括8步：（1）底物结合；（2）丝氨酸亲核攻击肽键的羰基碳原子；（3）四面体崩溃；（4）氨基组分释放；（5）水分子结合；（6）水分子亲核攻击酰化酶中间体；（7）四面体崩溃；和（8）羧酸成分释放。虚线表示氢键。图9.9 氧负离子洞。胰凝乳蛋白酶促反应的氧负离子中间体用氧负离子洞稳定。氧负离子洞的肽键NH与氧负离子中间体形成氢键（绿色虚线）。该机制能够解释胰凝乳蛋白酶促反应的所有特征，但不能解释这个酶的底物特异性。考察酶与底物类似物和抑制剂形成复合物的三维结构，发现酶分子有一个相对疏水的深口袋，成为S1口袋，适于长的非极性氨基酸侧链。适当侧链与该口袋结合将邻位肽键定位于断裂位点（图9.10）。胰凝乳蛋白酶的底物特异性几乎完全取决于肽键N-端的氨基酸侧链。其他蛋白酶的底物特异性更为复杂（图9.11）。这些酶表面还有其他口袋识别分子的其他残基。断裂肽键的N-端残基分别称为P1，P2，P3（从C-断向N-端编号），断裂肽键C-端氨基酸残基分别是P1, P2, P3（从N-端向C-端编号）。相应地，结合这些位点的口袋对应地称为S1, S2或S1, S2等。图9.10 胰凝乳蛋白酶特异性口袋。胰凝乳蛋白酶底物结合口袋用相对疏水的残基构建、很深，有助于结合长的疏水性残基如苯丙氨酸（绿色）侧链。活性位点195位Ser定位在断裂肽键。构成结合位点的关键残基已经标出。图9.11 蛋白酶和底物先互作用的命名方法。底物与酶潜在的相互作用位点用红色的P表示。酶分子相应的结合位点用S表示。断裂肽键（用红色标出）是这种命名的参考位点。其他水解酶也有催化三联体其他蛋白酶中很多有与胰凝乳蛋白酶相似的催化三联体。有些蛋白酶，例如胰蛋白酶和弹性蛋白酶，是胰凝乳蛋白酶的同源物。这些蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的序列一致性高达40%，蛋白质结构几乎相同（图9.12）。这些蛋白质的作用机理与胰凝乳蛋白酶相同。但是这三种蛋白酶的底物特异性差异很大。胰凝乳蛋白酶断裂芳香氨基酸或很长的疏水性氨基酸C端肽键，胰蛋白酶断裂长的带正电荷氨基酸（即精氨酸和赖氨酸）C-端肽键，弹性蛋白酶断裂侧链小的氨基酸（如甘氨酸、丝氨酸）C-端肽键。比较它们的S1口袋，发现底物特异性差异的原因在于S1口袋结构的细小差异。胰蛋白酶的S1口袋大，底部有一个Asp189酸性氨基酸，而胰凝乳蛋白酶同样位点是丝氨酸。天冬氨酸能够吸引，稳定底物分子带正电荷的精氨酸、赖氨酸残基与酶分子结合。弹性蛋白酶的口袋两边有两个Val，分别是Val 190和Val 216。这两个氨基酸残基的侧链挤占口袋空间，使之只能容纳小侧链的氨基酸残基（图9.13）。图9.12胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结构类似性。将胰凝乳蛋白酶（红色）置于胰蛋白酶（蓝色）之上，显示两者相似度很高。此处仅显示a-碳原子骨架。两种蛋白质分子之间a-碳原子误差是1.7A。图9.9 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、和弹性蛋白酶的S1口袋。有些氨基酸残基在决定这些酶的特异性方面起关键作用。用颜色标出了这些残基的侧链和活性位点的丝氨酸。胰凝乳蛋白酶家族的其他成员包括参与血液凝固的蛋白酶（在第10章讨论），以及肿瘤标记蛋白前列腺特异抗原（PSA）。此外，在细菌、病毒和植物中发现的很多蛋白酶也属于这一家族。还有些蛋白酶与胰凝乳蛋白酶不同源，但是也具有非常相似的活性位点。在第6章我们曾经介绍，同一进化使来源不同的蛋白质有相似的活性位点。枯草杆菌蛋白酶就是一个非常明显的例子。枯草杆菌蛋白酶也有催化三联体活性位点和氧离子洞，但是这个酶的氧离子洞的一个氨基来自天冬酰胺残基的侧链而不是肽链骨架（图9.14）。枯草杆菌蛋白酶属于另一蛋白酶家族，在古生菌、细菌、和真核生物发现了这一蛋白酶家族成员。图9.14 枯草杆菌的催化三体和氧负离子洞。氧负离子洞的两个氨基分别来自肽链骨架氨基和Asn 155的侧链氨基。这两个氨基能够稳定活性中心Ser 221亲核攻击肽键碳原子所形成的氧负离子。图9.15 羧肽酶II。小麦羧肽酶II的结构（右边），有两条肽链（分别用蓝色和红色标出）。活性中心的催化三体（左边）与胰凝乳蛋白酶的组成相同。但是该酶与胰凝乳蛋白酶没有相似之处。形成氧离子洞的氨基酸残基用黄色涂出。该蛋白质属于另一蛋白家族，包括乙酰胆碱酯酶和脂质酶。在这些酶中，用组氨酸活化的亲核试剂可能是半胱氨酸而不是丝氨酸。小麦羧肽酶II有催化三体，但是这个酶与胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶都没有明显的类似性（图9.15）。最后，还有一类蛋白酶活性位点的丝氨酸或苏氨酸不是用天冬氨酸-组氨酸对活化，而是用赖氨酸侧链氨基或肽链N-端氨基活化。因此，蛋白酶活性中心的催化三体在进化过程中产生的时间点至少有三个。这类催化策略在水解肽及相关化学键方面尤为有效。定点突变研究催化三体我们如何肯定活化中心是催化三体结构？用定点突变，然后测定各种变异的影响。用这种方法研究枯草杆菌蛋白酶的工作很深入。用Ala分别替代催化中心的Asp 32，His64，和Ser221，然后测定各突变蛋白酶切模式底物的活性(图9.16)。如同所料，活性位点Ser 221突变成Ala显著降低催化活性，kcat值只有野生酶kcat的百万分之一，Km值变化不大。Km值比野生酶Km值高两倍以内。His64突变成Ala64，催化活性的降低与Ser 221Ala突变相当，Asp32突变成Ala32队酶活性的影响幅度稍微小些，但酶促活性也只有野生酶的万分之零点五。将这三个位点的氨基酸都变成丙氨酸，突变效果与His64或Ser 221单位点突变的效果相当。这些结果支持“活性中心是催化三体，尤其是组氨酸-丝氨酸对联合作用产生活性足够的亲核试剂攻击肽键羰基碳原子”的观点。尽管这些位点突变会大大降低酶促反应活性，但是在缓冲液pH值为8.6时，这些突变体的催化蛋白水解的速度仍然比没有酶催化的蛋白水解速度快1000倍。图9.16 枯草杆菌蛋白酶定点突变。催化三体的残基突变成丙氨酸后，测定酶促活性。任一残基突变都显著降低酶促活性。注意，纵轴是对数轴。突变体命名，第一个字母是野生型酶的氨基酸缩写，后面的数字表示这个氨基酸所在的氨基酸序列位置，后面一个字母表示该位点的突变氨基酸。Uncat是没有催化剂的反应效率（估计值）。定点突变也能研究氧离子洞对催化反应的重要性。Asn 155突变成甘氨酸能消除枯草杆菌氧负离子洞的一个氨基，kcat值降至野生型酶的0.2%，Km值增加两倍。这些结果显示天冬酰胺的NH基团在稳定羰基碳四面体中间物以及形成该四面体的转化态方面起重要作用。其他种类的肽水解酶是半胱氨酸、天冬氨酸、和金属蛋白酶并非所有的蛋白水解酶都使用活化丝氨酸残基，还有其它活活残基水解肽键（图9.17）。这些蛋白水解酶分别是（1）半胱氨酸蛋白水解酶，（2）天冬氨酸蛋白水解酶，和（3）金属蛋白水解酶。各种蛋白酶都产生一种亲核试剂，攻击肽键羰基碳原子（图9.18）。半胱氨酸蛋白酶的酶促机理与胰凝乳蛋白酶酶促机理最相似。半胱氨酸蛋白酶组氨酸残基活化的半胱氨酸亲核攻击肽键(图9.18)的方式与丝氨酸蛋白酶丝氨酸颇为相似。研究最深入的半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶(papain)。这个酶是从木瓜分离的。与木瓜蛋白酶同源的哺乳动物蛋白酶是组织蛋白酶(cathepsins)。组织蛋白酶在免疫系统和其他系统起作用。在进化过程中，半胱氨酸蛋白酶至少独立出现两次。Caspases也是半胱氨酸蛋白酶，负责细胞凋亡，但是它们的结构与木瓜蛋白酶没有关系。天冬氨酸蛋白酶活性位点中心有一对天冬氨酸，它们联合作用活化水分子，后者攻击肽键。一个天冬氨酸是去质子状态(即解离状态，属于碱催化剂)，它攻击水分子使之脱去质子。另一个天冬氨酸是结合质子的状态（没有解离），使肽键极化导致肽键对亲核攻击敏感（图9.18）。这类蛋白酶包括肾素。肾素能调解血压和胃蛋白酶(pepsin)活性。天冬氨酸蛋白酶结构近似二重对称。可能的情况是基因重复产生两考贝基因发生融合，变成编码单一多肽链的酶。每个考贝基因给活性位点提供一个天冬氨酸。在人免疫缺陷病毒(HIV)及其它反转录病毒中，这两个考贝基因已经融合成编码一条多肽链的基因（图9.19）。这些结果与酶早先可能是两个独立亚基的想法一致。图9.17 三类蛋白酶及其活性位点。半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶分别利用组氨酸活化半胱氨酸、天冬氨酸活化水分子、和金属活化水分子，产生亲核试剂。天冬氨酸蛋白酶肾素（renin）的两个半分子分别用红色和蓝色表示，显示天冬氨酸蛋白酶大致是二重对称的蛋白酶。图9.18 三类蛋白酶的活化策略。肽键羰基受到下列基团攻击：(A) 半胱氨酸蛋白酶中组氨酸活化的半胱氨酸；（B）天冬氨酸蛋白酶中天冬氨酸活化的水分子；和(C)金属蛋白酶中金属活化的水分子。金属蛋白酶中字母B表示碱（常常是天冬氨酸），有助于金属结合的水分子脱质子。最后一类蛋白酶是金属蛋白酶。这类蛋白酶的活性位点有金属离子（几乎总是锌离子）。金属离子活化水分子，后者亲核攻击肽键的羰基。嗜热细菌蛋白酶（thermolysin）和消化酶羧肽酶A是经典的锌离子蛋白酶。嗜热菌蛋白酶是锌蛋白酶家族成员。这个家族很大，包括基质金属蛋白酶（负责组织重构和组织降解）。但是羧肽酶A不属于这一家族。这三类蛋白酶活性位点的共同特征包括（1）活化水分子或其它亲核试剂，（2）极化肽键的羰基，和（3）稳定四面体中间物（图9.18）。蛋白酶抑制剂是重要药物有几种重要药物就是蛋白酶抑制剂。例如，调节血压的药物captopril就是血管紧张肽转化酶（ACE）的抑制剂。这个酶就是一个金属蛋白酶。Indinavir (Crixivan), retrovir, 和其他20多种治疗AIDS的药物是HIV蛋白酶抑制剂。HIV蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶。这个蛋白酶能够将多功能域的病毒蛋白质水解成活性形式。彻底阻止这一过程使病毒失去感染能力（图9.19）为了避免抑制剂的副作用，用作药物的蛋白酶抑制剂必需只抑制目标酶，不影响体内其它蛋白酶。图9.19 HIV蛋白酶是二聚体天冬氨酸蛋白酶。这个蛋白酶是两个完全相同的亚基构成的二聚体（分别用蓝色和黄色表示）。每个亚基有99个氨基酸。每个亚基给活性位点提供一个天冬氨酸。底物结合后，将关闭结合口袋的扇翼结构。图9.20 Indinavir是HIV蛋白酶抑制剂。Indinavir (crixivan)的结构与HIV蛋白酶底物多肽的结构比较。底物断裂化学键用红色标出。Indinavir与HIV蛋白酶的多肽底物相似。Indinavir的醇与四面体中间物很相似，其它基团与酶分子识别位点S2, S1, S1，和S2结合（图9.20）。X-射线晶体学研究显示，在活性位点，indinavir采用的构型能够接近于蛋白酶蛋白的二重对称结构（图9.21）。结合后HIV蛋白酶活性位点为可变翼盖住。抑制剂中心醇的羟基与活性位点的两个Asp相互作用。此外，抑制剂的两个羰基与水分子形成氢键（在图9.21没有绘出），而这些水分子又与两翼的肽键NH基团形成氢键。抑制剂与水分子和酶分子相互之间的这种互作模式，是不可能在抑制剂与细胞天冬氨酸蛋白酶（如肾素）之间发生的。因此这些相互作用可能决定indinavir抑制HIV的特异性。图9.21 HIV蛋白酶-indinavir复合物。（左边）HIV蛋白酶活性位点与抑制剂indinavir结合。（右边）旋转药物显示抑制剂接近于二重对称。9.2 碳酸脱水酶使快速反应的速度更快CO2是有氧代谢的最终产物。哺乳动物的CO2释放到血液并被运输到肺呼出。在红细胞内CO2与水反应生成碳酸（7.3节）。反应产物是中等强度的酸（即碳酸），其pKa值是3.5，能释放一个质子解离成碳酸氢根（HCO3-）。即使没有催化剂，CO2的水合速度也很快。在37，中性pH条件下，二级反应的速度常数k1是0.0027M s-1。因为水分子浓度是55.5 M，因此该反应的速度常数相当于一级反应速度常数k1 =0.15 s-1。而碳酸脱水生成CO2的逆反应速度更快（k-1 = 50 s-1）。相应的平衡常数K1 = 5.4 x 10-5，即CO2与H2CO3在平衡时的浓度比达到340 : 1。CO2水合和HCO3-脱水常常与快速过程（尤其是运输过程）偶联。因此几乎所有生物都有碳酸脱水酶。碳酸脱水酶能够将反应速度增加到自动反应的合理速度之上。例如当血液流过肺，碳酸脱水酶将HCO3-脱水生成CO2。相反，碳酸脱水酶能够将CO2水合生成HCO3-，产生眼泪或其它分泌液。而且HCO3-和CO2是不同酶促反应的产物或底物。快速转化HCO3-和CO2才能保证这些分子处于合适的浓度水平。这些酶促反应非常重要。碳酸脱水酶突变会导致骨质硬化（osteopetrosis）(密度过高，伴随贫血)和精神障碍。碳酸脱水酶能加速CO2水合生成HCO3-。活性最高的碳酸脱水酶水合CO2的速度达到kcat = 106 s-1，即一个酶分子每秒能转化100万分子。基本的物理过程如扩散和质子转移达不到这么高的水合速率，因此酶促反应必需采用特别的策略获得如此巨大的（prodigious）速度。碳酸脱水酶含有催化活性必需的锌离子 在发现碳酸脱水酶（1932年）10年后，人们发现这个酶有锌离子。而且证实锌离子是酶活性必需的。这是第一例含锌离子的酶。在当时是个重大发现。现在我们知道，生物体有很多含锌的酶。实际上生物体内超过1/3的酶要么含有金属离子，要么利用金属离子作为辅助因子。金属离子有几个性质增加反应活性：带正电荷；能形成相对强但相当活泼的化学键；有时金属离子有多种氧化状态。金属离子的化学反应性质提供了进化过程中很多酶利用金属离子进行催化的理由。x-射线晶体学研究提供了碳酸脱水酶的锌离子的详细而又直接的信息。人类基因组至少有7种碳酸脱水酶（每种酶都有自身基因）。这些碳酸脱水酶序列一致性明显，是同源酶。碳酸脱水酶II是红细胞的主要成分，是研究得最深入（图9.22），也是活性最高的碳酸脱水酶之一。图9.22 人碳酸脱水酶II及其锌离子位点的结构。（左边）锌离子与碳酸脱水酶II的三个组氨酸残基和一个水分子结合。（右边）锌离子处于酶分子中心区附近的裂缝内。生物体内的Zn均是+2价。锌原子基本上总是与四个或更多配体结合。在碳酸脱水酶中，酶蛋白的三个组氨酸的咪唑基占居锌离子的三个配位，水分子（或氢氧根离子，实际情况取决于pH值）占居第四个配位。由于占据配位键的分子是中性，因此Zn(His)3单位的总电荷仍然是+2。催化经过锌离子活化水分子锌离子复合物如何有利于二氧化碳水合？主要思路来自pH值对酶促二氧化碳水合反应的影响（图9.23）。图9.23 pH对碳酸退水酶活性的影响。pH改变导致碳酸脱水酶II酶促二氧化碳水合反应速度改变。最大反应速度的pH值很高。在pH8，反应速度接近最大值。pH值降低，反应速度迅速下降。在pH7.0反应速度降低一半，提示pH7.0失去一个基团(pKa = 7.0)的一半，这个基团对催化反应很重要。而且这个曲线显示，高pH值（脱质子）形成该基团能有效地催化。尽管有些氨基酸，如组氨酸的pKa值接近7，但是不同证据提示负责转化的基团不是氨基酸而是锌结合的水分子。图9.24 锌离子结合水分子的pKa值。与锌离子结合使水分子的pKa值从15.7降低至7。水分子结合带正电荷的锌原子中心，使水分子的pKa值从15.7降低至7（图9.24）。随着pKa值降低，很多水分子在中性pH值就发生解离，产生足够浓度的氢氧根离子（结合于Zn原子）。锌结合的氢氧根离子是很强的亲核试剂，攻击CO2的能力比水分子强的多。锌结合氢氧根离子的重要性提示二氧化碳水合的简单机制（图9.25）。1. 锌离子有利于水分子释放H+离子，产生氢氧根离子。2. 二氧化碳底物结合于酶活性位点，并被定位于与氢氧根反应的位置。3. 氢氧根攻击二氧化碳，产生碳酸氢根离子（HCO3-）。4. 释放HCO3-后，又产生催化活性位点结合另一个水分子。图9.25 碳酸脱水酶催化二氧化碳水合反应的机制。锌离子结合羟基进行水合的机制显示金属离子催化的一个方面。反应过程有四个步骤：（1）水分子脱质子；（2）二氧化碳结合；OH-亲核攻击CO2；（4）水分子替代碳酸氢根。因此水分子结合于锌离子，促进质子释放形成结合的氢氧根（其位置与另一反应物二氧化碳很接近）有助于转化态的形成。用合成类似物进行的研究显示这种机制有道理。合成的配体有四个氮原子与锌离子结合（碳酸脱水酶是三个配位键）（图9.26）。一个水分子与锌离子还能形成配位键。直接测定显示锌结合水分子的pKa值是8.7，没有碳酸脱水酶结合水分子的pKa值那么低（但比游离水分子的pKa值显著降低）。在pH9.2，这个类似物催化二氧化碳水合速度提高100倍以上。尽管催化速度比碳酸脱水酶低很多，但是模型系统的实验结果暗示锌结合氢氧根离子的机制是正确的。碳酸脱水酶进化使之能够利用锌结合的氢氧根离子作为强催化剂。 图9.26 碳酸脱水酶的一个合成类似物。（A）化学合成的一个能够结合锌离子的类似物，最为碳酸脱水酶的模型。结合锌离子后，适当条件下这个化合物能够将CO2水合速度提高100倍。（B）假定的化合物-锌离子复合物结构，显示锌离子结合配体氮原子后还能结合一个水分子。质子穿梭有利于酶活性为点的快速再生如同我们早先所述，有些碳酸脱水酶催化二氧化碳的水合速度达到106 s-1。如此之高的速度可以从下列结果加以理解。二氧化碳水和反应得第一步，与锌离子结合的水分子必须丢失一个质子，产生酶的活化形式（图9.27）。逆反应（即氢离子与Zn结合氢氧根离子结合）的速度受氢离子扩散速度限制。质子扩散速度的二级反应常数接近10-11 M-1 s-1，因此逆反应的速度k-1肯定低于1011M-1 s-1。由于平衡常数K等于k1/k-1，因此正反应得速度常数k1=K k-1。如果k-11011M-1 s-1，K= 10-7M(因为pKa = 7)，则k1104 s-1。换句话说，栀子的扩散速度限定质子的释放常数低于104 s-1（当基团的pKa = 7)。但是二氧化碳的水合速度达到106 s-1，因此图9.25的各个步骤都得加快。如何解决这个矛盾？图9.27 水脱质子的动力学。碳酸脱水酶中锌离子结合水分子的脱质子反应和结合质子反应的动力学。当我们考虑到这个酶促反应需要缓冲液才能达到这么高速度这一点，就猜想到缓冲液的组分参与了酶促反应。缓冲液能够结合或释放质子。因此在中性pH时，质子或氢氧根离子的浓度限定在10-7M，缓冲液中相应离子的浓度也许比这个数值高出很多，达到毫摩尔量。如果缓冲液的pH值是7，那么图9.28的平衡常数是1。质子消除的速率是k1B。二级反应速度常数是k1和k-1，则缓冲液扩散限定这些值低于109M-1 s-1。而缓冲液浓度高于B = 10-3 M （1 mM），足以支持二氧化碳的水合速度达到106 M-1 s-1(因为k1 B = (109 M-1 s-1) (10-3 M) = 106 s-1。这种预测为实验证实（图9.29）。图9.28 缓冲液对脱质子反应的影响。缓冲液组分B协助锌结合水分子脱质子。图9.29 缓冲液浓度对碳酸脱水酶催化二氧化碳水合反应速度的影响。随着缓冲液1,2-二甲基苯咪唑浓度的增加，二氧化碳水合反应速率增加。缓冲液使酶催化产生很高的反应速率。很多缓冲液的分子组分太大，无法接近碳酸脱水酶的活性位点。碳酸脱水酶II有一种质子穿梭机制，允许缓冲液组分参与反应。这个穿梭系统的主要组分是His 64。这个氨基酸残基能够将锌结合水分子的质子传递到蛋白质表面，然后地送给缓冲液（图9.30）。碳酸脱水酶就是通过这个装置提升酶的催化功能的。由于质子参与很多生化反应，操纵活性位点的质子是很多酶进行催化的关键，说明酸碱催化在酶催化过程中非常重要。图9.30 组氨酸质子穿梭。（1）His64消除锌离子结合水的质子，产生亲核氢氧根离子和质子化组氨酸；（2）缓冲液B从这个组氨酸移去质子，再生没有质子化的组氨酸。同一进化(convergent evolution)使不同的碳酸脱水酶产生锌结合位点与人碳酸脱水酶同源的碳酸脱水酶叫a-碳酸脱水酶，常见于动物、一些细菌和藻类。此外，还发现了两类其他类型的碳酸脱水酶。这些碳酸脱水酶含有催化活性必须的锌离子，但是与a-碳酸脱水酶没有序列类似性。b-碳酸脱水酶见于高等植物和很多细菌，包括E.coli。光谱和结构研究显示b-碳酸脱水酶的锌离子与一个组氨酸和两个半胱氨酸残基结合，但是这个酶蛋白的总结构与a-碳酸脱水酶无关。在植物中，这些酶有助于CO2积累，CO2对光合成的Calvin循环是非常关键的。在古生菌Methanosarcina thermophila中鉴定的碳酸脱水酶属于第三类碳酸脱水酶，即g-碳酸脱水酶。晶体结构显示g-碳酸脱水酶锌离子的三个结合位点与a-碳酸脱水酶非常相像。但是锌离子的三个结合位点处于三聚体g-碳酸脱水酶三个亚基之间的界面（图9.31）。酶蛋白分子有非常显著的左手b-螺旋结构（b-链扭曲成左手螺旋），与a-和b-碳酸脱水酶的结构不同。因此，在进化过程中至少有三次同一进化。产生锌离子配位键结合的碳酸脱水酶。图9.31 g-碳酸脱水酶。（左边）g-碳酸脱水酶的锌离子位点。锌离子与三个组氨酸和一个水分子结合。（中间）这个蛋白的三聚体结构。三个亚基分别是A，B，和C。每条链主要是左手b-螺旋。（右边）从顶部观察这个三聚体，显示该蛋白呈三重对称。锌离子位置由绿色表示，处于亚基界面之间。9.3 限制性内切酶能高度特异地断裂DNA现在看看DNA水解反应。细菌和古生菌有一套保护自己免受病毒感染的机制。很多病毒将自己的基因组注入细胞。一旦病毒DNA进入细胞，病毒就能挟持细胞相关机器合成病毒蛋白质，进而产生子代病毒颗粒。一个病毒的感染常常导致宿主细胞死亡。宿主主要的保护机制是用限制性内切酶（也称限制酶）降解刚刚侵入细胞的病毒DNA。这些酶能识别目标核酸的特定序列（即识别序列或识别位点），在特定位置断裂DNA。前面我们在基因研究方法曾经介绍，限制性内切酶能够将基因或基因组断裂。研究的最深入的限制性内切酶是II型限制酶，它们在识别位点内部断裂DNA。其它类型的限制性核酸内切酶的切点不在识别位点，与识别位点之间有一段距离。限制性内切酶必须在两个水平上具有很高的特异性。第一，限制酶不得水解含有识别序列的自身DNA。第二，限制酶只水解含有识别序列的DNA分子，不得水解没有识别序列的核酸分子。如何使限制性内切酶只水解病毒DNA而不水解自身DNA?在大肠杆菌，限制酶EcoRV断裂含有5-GATATC-3的病毒DNA双链。但是EcoRV却并不断裂含有几百个这样的序列的大肠杆菌染色体。宿主DNA受到甲基化酶的保护。甲基化酶能够使宿主的识别序列的腺嘌呤甲基化（图9.23）。一旦宿主染色体识别位点腺嘌呤被甲基化，EcoRV就不能水解5GA*TATC-3。针对每个限制性核酸内切酶，宿主必须制造相应的甲基化酶将宿主DNA相应位点甲基化（作相应的标记）。这些成对的酶就是细菌的限制-修饰系统（restriction- modification systems）。图9.32 用修饰保护DNA。EcoRV的识别序列（左边），和免受这个限制酶断裂DNA的甲基化位点（右边）。限制性内切酶只断裂识别位点没有修饰的DNA，不水解其它DNA序列。6核苷酸序列的各种组合有46（即4096种），因此不被这个酶酶切的六核苷酸序列相当于该酶能够酶切的六核苷酸序列的4000倍以上。也就是说，限制性内切酶断裂识别位点的效率比它断裂非识别位点的效率高4000倍。现在看看是什么机制使限制酶具有如此高的酶切特异性。用镁活化的水分子在线替代磷的3-O，使DNA断裂限制性内切酶催化DNA骨架的磷酸二酯键水解。3-O与P原子之间的化学键断裂。断裂位点形成的产物3-端是羟基，5-端是磷酸（图9.33）。该反应是水分子亲核攻击磷原子。类比蛋白酶水解机制，提示核酸酶水解的两种机制。机制1是利用一个强亲核试剂，经过共价中间体，限制性内切酶断裂DNA。机制2是直接水解。图9.33 磷酸二酯键水解。所有限制性核酸内切酶催化DNA磷酸二酯键水解的产物是磷酸处于5-端。断裂化学键用红色标出。机制一 （共价中间体）机制二（直接水解）用两种亲核试剂攻击磷所形成的产物支持流水线替代正确。亲核试剂攻击磷原子，形成五个基团连接的转化态，即三角双锥体（中心是磷原子）。亲核攻击的基团（Nu）处于与被替代基团（L）相对立的双锥体顶部。亲核替代的结果是所有磷原子的构型发生反转，类似于四面体碳原子R和S型构型转换（2.1节）。两种机制的差别在于反应过程中替代反应的次数。第一种机制，酶上的亲核试剂（相当于胰凝乳蛋白酶的Ser 195）攻击磷原子形成共价连接的中间体，然后水解形成最终产物。在这种情况下，两次替代反应都在磷原子发生，因此P原子的构型是翻转、再翻转，回复到最初的构型。第二种机制类似天冬氨酸-和金属蛋白酶。活化的水分子直接攻击磷原子，断裂后磷原子的构型发生翻转。为了确定哪种机制正确，检测断裂反应后磷原子构型。由于磷原子与两个氧原子结合，因此直接观察是不行的。将一个氧原子换成硫原子（即硫代磷酸）就能解决这个问题。现在看看EcoRV的酶切反应。此酶断裂5-GATATC-3中央A和T之间的磷酸二酯键。第一步合成断裂位点是硫代磷酸的EcoRV底物（图9.34）。然后用富含18O标记水分子水解。18O相应于磷原子的位置确定磷原子的构型是维持还是转换。结果显示，磷原子构型转换了一次，证明水分子直接攻击导致磷酸二酯键断裂。酶促反应过程中没有共价中间体这一步（图9.35）。图9.34 用硫代磷酸标记。硫代磷酸二酯键中，硫代替没有参与核苷酸连接的一个氧原子。用硫原子替代能够观察酶促水解反应的立体化学过程。此处将硫代磷酸置于EcoRV能够断裂的位点。图9.35 DNA裂解得立体化学。EcoRV酶促反应断裂磷酸二酯键导致磷原子构型完全翻转（此时磷原子与一个硫原子，一个18O原子，一个16O原子，和一个与核苷酸连接的16O原子结合）。这一结果强烈提示限制性内切酶促反应是水分子直接攻击磷原子。限制性内切酶催化活性需要镁离子作用于含磷酸底物的很多酶，其催化活性需要Mg2+或类似的二价阳离子。限制性内切酶需要一个或多个Mg2+或类似的二价阳离子才有催化活性。这些金属离子的作用是什么？在Mg2+或类似的二价阳离子存在的情况下，将酶蛋白与底物分子结晶能够直接观察酶蛋白与底物之间的复合物是不可能的。因为酶蛋白能够裂解底物。但是，可以通过几种途径观察酶蛋白与金属离子形成的复合物。一条途径是没有Mg2+或类似的二价阳离子时，将酶蛋白与识别序列（即配体）混合后结晶。由于缺乏金属离子，能够长出相应得晶体。然后将相应得蛋白质晶体置于含有金属离子的溶液中浸泡。另一种方案是用活性很低的突变酶与相应的底物、金属离子一道结晶。最后用Ca2+替代Mg2+，将酶蛋白、底物和金属离子一道结晶（Ca2+作为辅助因子，酶蛋白的催化活性很弱）。所有这些操作都是使酶促反应不发生，从而能够确定金属离子的位置。由于每个活性位点有三个金属离子。多个金属离子在活性位点的具体作用仍在研究中。一个金属离子结合位点在所有结构（指前面不同方法所获得的结构）都出现。这个金属离子与蛋白质两个天冬氨酸和接近核酸断裂位点的一个磷氧基团形成配位键。该金属离子协助水分子定位，并活化水分子（类似碳酸脱水酶的Zn2+活化水分子），结合的水分子攻击磷原子（图9.36）。图9.36 EcoRV核酸内切酶的一个Mg2+结合位点。镁离子活化水分子，协助水分子定位，使之能够攻击磷原子。DNA配体与酶蛋白结合才能构建完整的催化装置，保障酶促反应特异性。现在来思考酶促反应特异性问题。大多数限制性核酸内切酶的识别序列是倒置重复。这样的识别位点，其空间结构是二重旋转对称（图9.37）。图9.37 EcoRV识别序列的结构。（A）识别序列是围绕轴（绿色）的旋转对称序列。（B）EcoRV识别序列的倒置重复具有二重旋转对称。限制性核酸内切酶也有相应的对称结构：二聚体酶的两个亚基也是二重旋转对称结构。酶与识别序列结构匹配有助于酶对DNA配体（即底物）的识别。蛋白质与带有识别序列的DNA分子形成的复合物结构证实酶与底物分子结构相似（图9.38）。酶紧紧地拥抱DNAs。图9.38 EcoRV拥抱DNA配体分子。从酶分子顶部沿DNA双螺旋轴朝下观察。两个蛋白亚基分别是黄色和蓝色。DNA骨架用红色标出。注意酶分子的二重对称轴和DNA的二重对称轴重叠。底物结合的亲和性常常决定酶促反应得特异性。但是在缺乏Mg2+时，酶蛋白结合DNA没有序列选择性，即配体和非配体DNA与EcoRV结合力相当。那么，为什么EcoRV只酶切配体DNA？答案在于酶蛋白与配体DNA在之间有一系列独特的相互作用。5-GATATC-3序列中，5-端的G和A与每个亚基的环（凸出在酶蛋白外）的氨基酸残基相互作用（图9.39）。酶与配体DNA结合形成复合物的最显著特征是DNA发生扭曲，DNA识别序列中心翘起。这个中心（即TA）本身与酶蛋白没有直接接触，但是非常重要（因为5-TA-3所形成的碱基对易于扭曲，是目前已知的最易变形的碱基对）。图9.39 EcoRV拥抱DNA底物分子之间形成的氢键。右边EcoRV分子的一个DNA结合环（绿色）与配体DNA分子之间的结合。图B显示与CG碱基对形成氢键的EcoRV酶蛋白分子的氨基酸残基，图C显示与TA碱基对形成氢键的EcoRV酶蛋白分子的氨基酸残基。与非配体DNA形成的复合物，结构与此差异明显。非配体DNA与EcoRV的结合基本上不扭曲（图9.41）。部扭曲就不会被酶催化水解。因为没有扭曲，就没有一个磷酸二酯键足以接近活性位点的天冬氨酸，因为不能构建出完整的Mg2+结合位点（图9.36）。因此，非配体DNA与EcoRV结合不能构建出完整的酶促反应的活性位点。底物扭曲及随后的Mg2+结合解释了EcoRV酶切配体底物的特异性比酶切非配体DNA特异性高100万倍的理由。因此，酶特异性的决定因素是酶促作用的特异性而不是酶与底物结合的特异性。图9.40 识别位点的扭曲。DNA用球-棒模型表示。DNA双螺旋轴用红线表示。与酶结合发生明显扭曲。B型DNA双螺旋轴是直的(没有绘出)。图9.41 EcoRV与配体及非配体DNA分子的结合。非配体DNA(橘色)和配体DNA(红色)与EcoRV酶蛋白分子的结合。注意非配体DNA与蛋白质结合因距离太远，无法构建完整的Mg2+结合位点。现在看看DNA与EcoRV的结合能对催化特异性的贡献。DNA扭曲增加了酶分子与DNA的接触，因此增加结合能量。但是，DNA扭曲要消耗能量（图9.42）。结果，EcoRV与配体DNA和非配体DNA结合能量相当，亲和力几乎没有差别。但是，配体DNA与EcoRV的结合使DNA双链发生扭曲构成了一个完整的Mg2+结合位点，能够实施酶催化的裂解反应。这个例子指出酶分子如何利用结合能扭曲底物分子，使之能够进行化学反应。酶蛋白-扭曲DNA复合物分子间互作稳定转化态，导致DNA水解。图9.42 与非配体DNA相比，配体DNA与EcoRV的结合能高。配体DNA与EcoRV分子结合多余的结合能（与非配体DNA-EcoRV复合物相比）用于DNA扭曲，从而构建出完整的催化活性位点。DNA扭曲的机制能够解释甲基化阻止限制性内切酶活性，从而保护宿主DNA的机制。宿主EcoRV甲基化酶使5-GATATC-3的5-端腺嘌呤碱基发生甲基化。腺嘌呤氨基的甲基化使这个腺嘌呤与酶蛋白Asn185的侧链羰基无法形成氢键（图9.43）。由于Asn185与蛋白质的其它氨基酸残基相关联，Asn185与这个腺嘌呤碱基形成氢键就能够使酶分子其它氨基酸残基与DNA进一步相互作用。阻止Asn185与DNA形成氢键，其它作用就不可能发生，DNA分子也不会扭曲，酶催化的蛋白质裂解也不会产生。图9.43 腺嘌呤甲基化。腺嘌呤甲基化阻止EcoRV与配体DNA之间形成氢键，因此阻止了DNA的酶促断裂。第II类限制性内切酶有相同的催化核，可能是水平基因转移产生的。第二类限制性内切酶在细菌和古生菌很普遍。这些酶的进化历史是什么？比较不同的II类限制性核酸内切酶显示大多数蛋白之