一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法.pdf

蔷 簿 3 0 6 泸州 医学 院学 报 2 0 0 3年 第 2 6卷 第 4期 J o u r n a l o fld l z h o aMe d i c a l C o l l e g e Vo 1 2 6 No 4 2 0 0 3 一 种 简 单 的肝 细 胞 分 离 培 养 和 鉴 定 方 法 谢华福 甘淋 李娟 刘 晓燕 宋杰 李洪 泸州医学院 分子生物实验室 生物化学教研室 四川泸州6 4 6 0 0 0 摘要 目的 建立一种简单 的肝细胞分离 培养和鉴定方法 方法 取新生大鼠 成年小 鼠的肝组织 立 即剪 碎 铜网过滤 R P M I 一1 6 4 0培养基培养 2 4小时后换液 除去血细胞后进一步培养 形态学观察 并用 P A S p e r i o d i e a c i d S c h i 染色法鉴定 结果 在光镜可见分离 培养的肝细胞折光性强 呈圆形 偶见梭形 核 大而 圆 具有双核细 胞 P A S染色后 胞质中布满粉红色糖原颗粒 核呈空泡状 结论 本实验方法可获得较纯的肝细胞 而且操作简便 可行 经济实用 关键词鼠 肝细胞 细胞培养 中图分类号R 3 4 文献标识码A 文章编号1 0 0 0 2 6 6 9 2 o o 3 o 4 0 3 0 6 0 3 肝细胞形 态规 整 具有多种重要 功能 是生命 科 学研究 中最 常用 的实验材 料之一 肝组织 细胞构成 丰富 既有组成肝实 质 的大量 肝细 胞与 少量 间质 细 胞 其血窦 中又有大量血 细胞 尤其 以红 细胞数量较 多 因此在体外分离 培养高纯度肝实质细胞是是 进行各项实验 研究 的前提 具有 重要 的意 义 本 文 以研磨 过 滤 的方法 分 离 新 生 大 鼠 成 年 小 鼠肝 细 胞 并进行原代培养 最后用 P A S染色染肝细胞胞 质中糖原 以鉴定 获得 了数 量 较 多 较 纯 净 的肝 细 胞 为肝细胞体外培养研 究奠 定了基础 1 方 法 1 1 试剂 R P M I 一1 6 4 0培 养基 购 自 G i b c o公 司 产 品 小 牛血清 成都市华 星生化制品厂 碱性 品红 偏重亚 硫 酸钠 过碘酸 购 自上海试剂厂 1 2 肝细胞的分离及培养 取新生大 鼠 出生 l 3天 或成 年小 鼠 在无 菌 条件 下 剖 腹 取 出 肝 组 织 P B S清 洗 后 剪 为 约 l 大小的碎块 再清洗 去掉 血凝 物 经 1 5 0目铜 网研磨 过滤 获 得肝 细胞悬 液 1 2 0 0 r p m离心 l 0分 钟 吸去上清液 加入 f u P M I 一1 6 4 0培养基吹打混匀 按 3 5 l 0 5 个细胞 m l 的密度接种于培养瓶内 培 养瓶 内事 先 已放 入 无 菌 的 盖玻 片 置 细 胞 于 5 C O 2 9 5 空 气 3 7 9 0 湿 度 的培 养 箱 中 2 4小 时后更换新 培养基 以去掉 血细 胞 血 细胞 不贴 壁 和细胞碎 片 并在镜下观察细胞生 长及存活情况 作者简介 谢华福 1 9 5 3一 女 实验师 国家 自然科学 基金 资助 项 目 项 目编号 7 o 0 7 1 o 4 o 以后每 2 3天更 换培 养基 1 3 不 同培养基的 比较 在上述方 法基础 上用 D M E M代 替 R P MI 1 6 4 0 培养基对肝细胞进行对照培养 1 4 肝 细胞不 同培养方式 的 比较 将分离 的肝细胞悬液接种于培养瓶 内后随机分 为 2组 第 l 组 培 养 2 4小 时后更 换 全液 第 2组 培养 2 4小时后更换半液 1 5 培养肝细胞的糖原染 色 P A S染色法 待肝 细胞 生长成 片后 取 出盖 片 依 次进 行 0 9 的生理盐水 清洗 两 次 每 次 约 3分 钟 7 0 酒精 固定约 l 0分钟后 P A S染色 封 片 镜下观察 2结 果 2 1 培养肝细胞的活体观察 肝细胞培养 2 4小时后在倒置显微镜下 可 见肝 细已贴 壁 圆球型 折光性 强 7 2小 时后可 见肝细胞 有梭形 三角 形 折光 性强 核大 而 圆 5 l 0天 可 见到有 双 核 细 胞 细 胞 数 量 增 多 并 长 成 片 见 图 1 2 2 新生大 鼠和成年小 鼠培养状况 的比较 在新 生 大 鼠和成年 小 鼠肝细胞 的培养 均 获得 满意的结果 说明该方法 适用 与体外不 同生物来源 的肝组织细胞 的培 养 拓展 了方法 的应用范 围 2 3 培养肝 细胞 的鉴定 P A S染色后 1 0 物镜下见 大量肝细胞 胞 质呈 粉红色 未见胞 核 4 0 物镜下见肝细胞胞质 中密集 粉红色糖原颗粒 胞核呈空泡状 见 图 2 第 4期谢华福等 一种简单的肝细胞分离 培养和鉴定方法 3 0 7 图 1 培养 4 8 h 后肝细胞的光镜照片 4 O 3讨 论 3 O多年来 G u g u e n等 u j 的两 步胶原 酶灌注法 分 离获得 肝细胞 的方法 几 乎成 了肝 细胞 分离 的经 典 方法 在此基 础上又发展 了多种不 同的培养方法 如 在培养 瓶 内加纤 连 蛋 白 f e b r o n e c t i n 以促 进 肝 细胞 附壁l 2 添 加生 长 因子于培 养 基促 其 生长等 但 上 述方法步骤繁琐 成本较 高 且两步胶原 酶灌 注法主 用于大 鼠肝细胞 的分 离 不适 于新 生 鼠肝细胞 的分 离 甚至分离成 年 小 鼠肝 细胞 都 因为血 管 的纤细 在实际应用 中也很 困难 为此我们在实 际工作 中通 过反复实验 摸索 出 了一 种较 为 简单 经 济 实 用 的 肝细胞分离 培养 和鉴定方法 通过不 同培养方式 的比较 发现在培养 2 4小 时 后换液 的方式 会影 响细胞 生 长状况 培养 3 5天 后观察 第 1 组 更 换全 液 比第 2组 更换 半液 的 肝细胞 纯度 更 高 细胞 折 光性 更 强 生 长情 况 也 更 好 这可能 因为第 2组 的换 液法会 残 留细胞 碎片 血细胞 对 肝细胞 生 长不 利 结果 显示 第一 次换 液 最好在培养 2 4小 时 内换 全液 这样对 肝细胞生 长创 造更好的生长 营养条件 图 2 肝细胞的糖原染色照片 不 同培养基 的对 比中发 现 D ME M培 养基 培养 肝细胞生 长状况 与 R P MI 一1 6 4 0培 养基类似 说 明该 方法可适用 于不 同类 型的培 养基 本 实验利用 肝组 织脆性 大这一 特点 通 过研磨 过滤去处结缔组织 获得单细胞悬液 利用肝细胞贴 壁生 长 的特 点 于培 养后 2 4小 时 即全 部 更换 培养 基 除去大量悬 浮生 长 的血细 胞 获得 了数量 丰 富 生长 良好 的肝细胞 利用肝 细胞 内含有大量糖原颗 粒的特点 进行糖原染色 可对培养的肝细胞进行鉴 定 全部 实验 过程 步骤 简单 成本 低廉 获得 的肝 细胞量大且纯度较 高 稳定性好 应用范 围较广 的优 点 为肝 细胞体外培养研究奠定 了 良好 的基础 参考文献 1 Gu g u e n C Gu i H o U T X A B o i s n mfl M e t a 1 U l t r a s t r u c t u r a l s t u d y o f mo n o l a y e r h e p a t o c y t e s i n a d L d t ml c u l t u r e s i n t h e p r e s e n o e o f h y d r o c o r t i s o n e h e m i s u c c i n a t e J B i o l G a s t r o e n t e r o l 1 9 7 5 8 2 2 3 2 张卓 然 实用细胞培养技术 M 北京 人民卫生 出 版社 1 9 9 9 6 4 6 6 3 司徒镇强 吴军正 细胞培 养 M 世界 图书 出版公 司 1 9 9 6 9 8 1 0 0 2 0 0 3 0 3 1 5收稿 泸州 医学 院学 报 2 0 0 3年 第 2 6 卷 第 4期 J o u r n a l o f I A I g h o u Me d i c a l C o l l e g e Vo 1 2 6 No 4 2 0 0 3 A Sn P I 珏l THoD FOR HEPATOCYTES S E 姒T ON 几 瓜 E EVAI Ar rI oN Xi e Hu a f u e t al L a b o r a t o r y o fMo l e c u l a r B i o l o g y L i l h o u Me d i c a l C o l l e g e A b s t r a c t Ob j e c t i v e T o e s t a b l i s h a s imp l e m e t h o d f o r t h e s e p a rat i o n c u l t u r e a n d e v alu a fi o n o f h e p a t o e y t e s Me t l ls T h e l i v e r t i s s u e o f n e w b o m r a t s an d ma t u r e mi c e wa s s e p a r a t e d an d c u t i n t o p i e c e s i mme d i a t e l y fi l t e r e d wi t h c o pp e r d an d c u l t u r e d wi th RPMI一 1 6 4 0 c ult u r e me d i u m Th e b l o o d c e l l s we r e g o t t e n r i d o f b y c h an g i n g f r e s h c u l t ur e me d i u m a f t e r 2 4 h o u r s an d the c e l l s we r e c ult u r e d c o n t i n u a l l y Th e mo r p h o l o g y o f the c ult ur e d h e p a t o e y t es Was o b ser v ed and e v a l u a t ed b y u s i n g P A S peri o d i c a c i d S e h i ff s t a i n i ng R e s u s U n d e r mic ros c o pe the sep a r a t e d and c u l t u r e d h e p a t o e y t e s r e fl ect l i g h t w e l l u s u a ll y r o u n d i n s h ape Nu c l e i a r e b i g an d mu n d b i n u c l e a t e p a r t l y Th e r e a l e fi fl l o f p i n k g l y c o g e n p a r t i c l e s i n c y t o p l asm an d v a c u o l a r n u c l e u s a f t e r P AS s t a i ng Co n c l u s i o n Th e me tho d c a n o b t a i n p u r e r h y p a t o e y t e s an d i t i s s i mp l e a n d e c o n o mi c al f o r the e x pe r i me nts Ke y wor d s Mo u s e Hy p a t o c y t e Ce ll c u l t u r e 妊娠 合 并 原发 性 卵巢 恶性淋 巴瘤 尧名方 尧名英 唐云 重庆梁平县人民医院 重庆梁平4 0 5 2 0 0 卵巢肿瘤是妇科的常见病之一 其中卵巢恶性肿瘤 占卵 巢肿瘤的 9 3 2 0 7 而卵巢原发性恶性淋巴瘤极少见 本 文报告 1 例如下 1 临床资料 患者 女 2 9岁 孕 2产 1 停经 5个月 伴右下 腹疼痛 2 8 天 加重 4天 于 2 0 0 1 年 3月 4日入院 入院前 2 8天 始 感下腹阵阵隐痛 无规律性 可忍受 4天前 病 情加重 右 下腹持续钝痛 阵发性加剧 腹胀明显 神疲 纳差 患者怀孕 4 月出现胎动 近 日感胎动次数减少 减弱 查体 体温 血压均正常 痛苦表情 巩膜及全身皮肤轻 度黄染 浅表淋 巴结 未扪 及 腹 膨 腹壁张力高 右下腹 压 痛 无反跳痛 未扪及明显包块 移浊明显 宫底脐上 3 c m 子 宫张力不大 胎心音微弱 心率 1 4 1 次 分 实验检查 血常规正常 腹水为漏 出液 凡登 白直接立即 反应强阳性 A F P阴性 临床诊断 7月孕合并右卵巢肿瘤转 恶性 终止妊娠 切除肿瘤 术中见 腹腔草黄色积液约 5 0 0 0 m l 于子宫下段横行切 开 取出一死胎 右侧卵巢有一 1 5 c m X 1 0 c m X 8 c m肿物 灰 白色 质软脆 似 肉芽状 与周 围组织广泛粘连 切除右侧输 卵管 卵巢和肿块 探查腹主动脉旁淋 巴结 黄豆 大小 余无 异常 病理检查 附有输 卵管组 织 的肿块 一个 肿块 大 小为 1 4 c m l O c mX 8 c m 灰白色 有不完整包膜 外 附黄 白脂肪组 织 质