微生物的生长于繁殖.ppt

第五章菌种的制备和保藏 第一节微生物的生长 繁殖1 概述2 细菌的繁殖3 放线菌的生长于繁殖4 霉菌的繁殖5 微生物的生长的测定6 群体生长规律 同化作用 生物体吸收外界成分并转化成为自身成分 如摄取营养物转变成细胞内有功能的成分 异化作用 体内成分通过代谢生成非机体本身所需要的物质 如体内成分降解成代谢废物而排出体外的过程 如果同化作用大于异化作用 表现为生长 就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加 在单细胞微生物 细菌 中 生长往往伴随着细胞数目的增加 在单细胞微生物 细菌 中 由于细胞分裂而引起的个体数目的增加 称为繁殖 在多细胞微生物 霉菌 中 细胞数目的增加如不伴随着个体数目的增加 只能是生长而不是繁殖 一 细菌生长繁殖的条件1 充足的营养物质 水 含碳化合物 含氮化合物和无机盐是基本的营养成份 生长因子 2 合适的酸碱度 多数病原菌生长繁殖的最适pH为7 2 7 6 3 适宜的温度 多数病原菌最适宜的温度是37 4 必需的气体环境 主要指氧和二氧化碳 细菌与人类不同 并非所有细菌的生长都需要氧气 根据对氧的需要 可把细菌分为四类 专性需氧菌 只能在有氧的环境下生长繁殖 如霍乱弧菌 微需氧菌 在低氧分压 5 6 环境中生长最好 如幽门螺杆菌 厌氧菌 必须在无氧环境中才能生长 如破伤风梭菌 兼性厌氧菌 在有氧或无氧环境中都能生长 大多数病原菌属于此类 二 细菌的繁殖方式和速度 1 繁殖方式细菌以无性二分裂的方式进行繁殖 球菌可从不同的平面分裂 分裂后形成不同的排列 如双球菌 链球菌 葡萄球菌等 杆菌一般沿横轴进行横断分裂 形成链杆菌等 2 繁殖速度在适宜的环境中 一般细菌20 30分钟分裂1次 个别细菌如结核分枝杆菌约18 20小时才分裂1次 细菌分裂一次称为繁殖一代 若以20分钟分裂1次计算 经过10小时 1个细菌将繁殖成10亿个以上 但由于营养物质消耗 代谢产物的堆积等环境改变 经一段时间 细菌繁殖速度会逐渐减慢 甚至死亡 三 细菌的人工培养 1 人工培养的意义 1 传染病的诊断与治疗 2 生物制品的制备 3 细菌的鉴定与研究2 培养基是由适合于细菌生存的各种营养物质配制而成的营养基质 按用途可分为基础培养基 营养培养基 鉴别培养基 选择培养基和厌氧培养基等 按物理性状可分为液体 固体和半固体培养基 在液体培养基中加入一定量的凝固剂 多为琼脂 即成为固体或半固体培养基 1 细菌A 细菌的结构 B 细菌的繁殖 细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖 C 细菌的菌落定义 单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时 会形成一个肉眼可见的 具有一定形态结构的子细胞群体 叫做群落 特征 大小 形状 光泽度 颜色 硬度 透明度等 功能 每种细菌在一定条件下所形成的菌落 可以作为菌种鉴定的重要依据 举例 如啤酒酵母菌落 红酵母菌落等 几种菌落特征 放线菌 actinomycete 一类呈菌丝状生长和以孢子繁殖的原核微生物 第二节放线菌 菌丝状 多无隔膜 为多核单细胞菌丝较细 直径多为0 5 1微米细胞壁组成与细菌类似 革兰氏染色多为阳性细胞一般结构与细菌相似根据菌丝的形状和功能不同分为 营养菌丝 气生菌丝和孢子丝 以链霉菌属最为典型 一 放线菌的典型形态构造 1 营养菌丝 2 气生菌丝 3 孢子丝 气生菌丝分化的具有形成孢子作用的繁殖菌丝 4 孢子 孢子丝生长到一定阶段 形成一串孢子 成熟后孢子就单个释放 孢子的形状 颜色和孢子表面状况等也是菌种鉴定的重要依据 孢子在适宜的条件下萌发 长出1 3个芽管 营养菌丝 气生菌丝 繁殖菌丝 孢子丝 孢子丝释放孢子 放线菌以无性方式繁殖 主要是通过形成孢子 也可以通过菌丝断片繁殖 少数菌种和液体培养中 孢子形成的方式 孢子丝成熟后断裂成孢子 基内菌丝顶端形成孢子 孢子丝特化形成孢囊 由内部产生孢子 二 放线菌繁殖 不同孢子的形成方式 1 极性生长 顶端菌丝的延伸 2 分化培养基提供营养 气生菌丝才是生长 但有菌丝自溶 菌落干重没有发生变化 3 孢子形成4 分枝5 形态变化的顺序 3 酵母菌A 酵母菌形态酵母菌细胞的形态通常有球形 卵圆形 腊肠形 椭圆形 柠檬形或藕节形等 比细菌的单细胞个体要大得多 一般为 1 5 5 30 微米 酵母菌无鞭毛 不能游动 具有典型的真核细胞结构 有细胞壁 细胞膜 细胞核 细胞质 液泡 线粒体等 有的还具有微体 酵母菌的细胞形态 B 酵母菌菌落大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似 但比细菌菌落大而厚 菌落表面光滑 湿润 粘稠 容易挑起 菌落质地均匀 正反面和边缘 中央部位的颜色都很均一 菌落多为乳白色 少数为红色 个别为黑色 啤酒酵母的菌落 红酵母的菌落 各种酵母菌的菌落 C 酵母菌的繁殖无性繁殖 芽殖 酵母菌最常见的无性繁殖方式是芽殖 芽殖发生在细胞壁的预定点上 此点被称为芽痕 每个酵母细胞有一至多个芽痕 成熟的酵母细胞长出芽体 母细胞的细胞核分裂成两个子核 一个随母细胞的细胞质进入芽体内 当芽体接近母细胞大小时 自母细胞脱落成为新个体 如此继续出芽 如果酵母菌生长旺盛 在芽体尚未自母细胞脱落前 即可在芽体上又长出新的芽体 最后形成假菌丝状 酵母菌的芽殖过程1 泡 2 小管 3 核 4 液泡 酵母菌假菌丝的形成图中1 2 3 4 是出芽的顺序 裂殖 是少数酵母菌进行的无性繁殖方式 类似于细菌的裂殖 其过程是细胞延长 核分裂为二 细胞中央出现隔膜 将细胞横分为两个具有单核的子细胞 有性繁殖 酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式进行无性繁殖的 两个临近的酵母细胞各自伸出一根管状的原生质突起 随即相互接触 融合 并形成一个通道 两个细胞核在此通道内结合 形成双倍体细胞核 然后进行减数分裂 形成4个或8个细胞核 每一子核与其周围的原生质形成孢子 即为子囊孢子 形成子囊孢子的细胞称为子囊 左图为酵母菌子囊孢子的形成过程1 2 3 4 两个细胞结合 5 接合子 6 7 8 9 核分裂 10 11 核形成孢子 4 丝状真菌 霉菌A 霉菌的形态霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝构成 许多分枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体 菌丝是中空管状结构 直径约2 10 m 霉菌菌丝类型 按形态分无隔菌丝和有隔菌丝 无隔菌丝 为长管状单细胞 细胞质内含多个核 其生长表现为菌丝的延长和细胞核的增多 这是低等真菌所具有的菌丝类型 有隔菌丝 菌丝中有隔膜 被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞 菌丝由多个细胞组成 每个细胞内有一至多个核 隔膜上有单孔或多孔 细胞质和细胞核可自由流通 每个细胞功能相同 这是高等真菌所具有的类型 按分化程度分营养菌丝和气生菌丝 营养菌丝 基内菌丝 伸入到培养基内部 以吸收养分为主的菌丝 气生菌丝 向空中生长的菌丝 气生菌丝发育到一定阶段可分化成繁殖菌丝 B 霉菌的菌落特征菌落特征 霉菌的菌落大 疏松 干燥 不透明 有的呈绒毛状 絮状或网状等 菌体可沿培养基表面蔓延生长 由于不同的真菌孢子含有不同的色素 所以菌落可呈现红 黄 绿 青绿 青灰 黑 白 灰等多种颜色 液体培养时的特征 如果是静止培养 霉菌往往在表面上生长 液面上形成菌膜 如果是震荡培养 菌丝有时相互缠绕在一起形成菌丝球 菌丝球可能均匀地悬浮在培养液中或沉于培养液底部 霉菌菌落正反面颜色呈现明显差别 原因是由于气生菌丝分化出来的子实体和孢子的颜色往往比深入到固体基质内的营养菌丝的颜色深 而菌落中心与边缘颜色 结构不同的原因是因为越是接近中心的气生菌丝其生理年龄越大 发育分化和成熟的年龄越早 故颜色比菌落边缘尚未分化的菌丝深 结构更复杂 C 霉菌的繁殖 方式多样无性孢子或有性孢子孢子是生物所产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞 能直接发育成新个体 孢子一般微小 单细胞 由于它的性状不同 发生过程和结构的差异而有种种名称 生物通过无性生殖产生的孢子叫 无性孢子 如分生孢子 孢囊孢子 游动孢子等 通过有性生殖产生的孢子叫 有性孢子 如接合孢子 卵孢子 子囊孢子 担孢子等 直接由营养细胞通过细胞壁加厚和积贮养料而能抵抗不良环境条件的孢子叫 厚垣孢子 孢囊孢子 节孢子 厚垣孢子 概论 生长 细胞物质不可逆地增加 体积增大的过程 量变过程 繁殖 生命个体数量增加的过程 质变过程 在单细胞微生物中 生长繁殖的速度很快 而且两者始终交替进行 个体生长与繁殖的界限难以划清 因此实际上常用群体生长作为衡量微生物生长的指标 群体生长指在一定时间和条件下细胞数量的增加 实质上包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程 微生物生长的测定 评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制 或杀死 作用的效果 客观地反映微生物生长的规律 评价培养条件 营养物质等对微生物生长的影响 微生物生长 P146 个体计数法通常用来测定细菌 酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量 微生物生长的测定方法 生物量测定 重量测定 生理指标测定 1 个体计数法 A 直接法 利用血球计数板 在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量 缺点 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度 个体小的细菌在显微镜下难以观察 B 间接法 原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落 稀释平板计数法先将待测菌液作一系列10倍稀释 使平皿上长出的菌落数在30 300个之间 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长 繁殖 肉眼可见的菌落 对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数 涂布平板法使用较多的常规方法 但有时涂布不均匀 一般0 2ml 同一稀释度三个以上重复 取平均值 每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液 样品充分混匀 每个平板上的菌落数目合适 便于准确计数 要求 每ml活菌数 同一稀释度平均数 稀释倍数 5注意 要三个以上重复平板平均计数 不适合丝状菌 C 比浊法在一定波长下 测定菌悬液的光密度 以光密度 opticaldensity 即O D 表示菌量 原理 悬液中细胞浓度与浑浊度成正比 细菌越大 透光量越小注意 样品颜色不宜太深 且无其他杂质测量应在菌浓度与O D 成正比的线性范围内 否则不准 2 重量法 通过样品中蛋白质 核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法 以干重 105 湿重直接衡量微生物群体的生物量 蛋白质含量测定法 从一定量培养物中分离出细菌 洗涤 以除去培养基带入的含氮物质 再用凯氏定氮法法测定总含氮量 一般细菌的含氮量约为原生质干重的14 故 蛋白质总量 含氮量 6 25蛋白质含量占细菌总重的 65 故细胞总量 蛋白质总量 1 54 DNA含量测定法 利用DNA与DABA 2HCl 即新配制的20 W W 3 5 二氨基苯甲酸 盐酸溶液 能显示特殊荧光反应的原理而设计的 因为每个细菌平均含DNA8 4 10 5纳克 可根据DNA含量计算出细菌的数量 3 生理指标测定法 样品中微生物数量多或生长旺盛 这些指标愈明显 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪 微量量热计等设备来测定相应的指标 常用于对微生物的快速鉴定与检测 微生物的生理指标 如呼吸强度 耗氧量 酶活性 生物热等与其群体的规模成正相关 第三节细菌群体的生长繁殖 研究细菌群体培养的原因 由于个体微小 微生物接种是群体接种 接种后的生长是微生物的群体繁殖生长 曲线特征 根据微生物每小时的分裂代数 R 不同 一般可把生长曲线分成迟缓期 延滞期 对数生长期 稳定期 衰亡期 一 细菌群体的生长规律 生长曲线 细菌接种到定量的液体培养基中 定时取样测定细胞数量 以培养时间为横座标 以菌数为纵座标作图 得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线 1 迟缓期 lagphase 定义 少量微生物接种到新鲜培养基 开始的一段时间内数目不增加的时期 特点 生长速率常数等于零 细胞形态变大或增长 巨大芽孢杆菌接种3 4 m 培养5 5小时 19 8 m 胞内RNA尤其是rRNA含量增高 合成代谢活跃 核糖体 酶类 ATP合成加快 对外界不良条件 氯化钠浓度 温度 抗生素等反应敏感 采取缩短延迟期的措施 在生产实践中 通常采取的措施有增加接种量 在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分采用最适种龄 即处于对数期的菌种 的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施 以缩短延迟期 加速发酵周期 提高设备利用率 延迟期出现的原因 可能是为了调整代谢 当细胞接种到新的环境 如从固体培养接种至液体培养基 后 需要重新合成必需量的酶 辅酶或某些中间代谢产物 以适应新的环境 影响延迟期的因素 菌种的遗传性 菌龄以及移种前后所处的环境条件等 2 对数期 logarithmicphase 又称指数期定义 延滞期之后细胞以几何级数速度分裂的一段时期 特点 生长速率常数最大 细胞代时 分裂一次 或倍增时间 原生质增加一倍 最短 细胞平衡生长 菌体内各种成分最均匀 酶活性活跃 代谢旺盛 影响指数期微生物增代时间的因素 菌种 不同菌种的代时差别极大 营养物浓度 营养物的浓度可影响微生物的生长速率和总生长量 E coli肉汤中37 代时17分钟 Nitrobacter agilis组合培养基中27 代时1200分钟 活化硝化杆菌 E coli牛奶37 12 5分钟 肉汤中37 17分钟 营养成分 同一种细菌 在营养物丰富的培养基中生长 其代时较短 反之则长 培养温度 温度对微生物的生长速率有极其明显的影响 应用 指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致 细胞成分平衡发展和生长速率恒定 故 作为代谢 生理等研究的良好材料 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 也是发酵生产中用作 种子 的最佳种龄 3 稳定期 stationaryphase 定义 对数期后 生长速率降为零的生长期 特点 1 生长速率为零 新产生细胞数 死亡细胞数 2 菌体产量 活菌数最大 3 细胞开始贮存糖原 异染粒 脂肪 多数芽孢杆菌开始产生芽孢 有的微生物开始合成次生代谢产物 原因 1 营养物耗尽 2 营养的比例失调 3 有害代谢产物积累 酸 醇 H2O2 4 pH值 氧化还原电势不适宜 稳定期于生产上的意义 生产菌体和与菌体平行生长的代谢产物 单细胞蛋白 乳酸 的最佳收获期 4 衰亡期 declinephase 定义 由于营养物耗尽 代谢产物积累 细菌死亡速度大于新生速度的时期 特点 细菌代谢活性降低 细菌衰老并出现自溶 产生或释放出一些产物 如氨基酸 转化酶 外肽酶或抗生素菌体细胞也呈现多种形态 有时产生畸形 细胞大小悬殊 有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应 二 生长数学模型 dN dt N N 每毫升培养液中细胞数 比生长速率 每单位数量细菌在单位时间增加的量t 培养时间 重要参数 1 繁殖代数 n x2 x1 2n 以对数表示 lgx2 lgx1 nlg2 n 3 322 lgx2 lgx1 2 比生长速率常数 lgNt lgN0 t t0 3 代时 G 在群体生长里 细菌数量增加一倍所需的时间 1 同步培养与同步生长同步培养 是一种培养方法 它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞 同步生长 通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态 三