广西地方标准《牛支原体肺炎防控技术规程》（征求意见稿）编制说明

广西地方标准牛支原体肺炎防控技术规程 （征求意见稿）编制说明一、任务来源根据广西壮族自治区质量技术监督局下达文件广西壮族自治区质量技术监督局关于下达 2016 年第六批广西地方标准制定（修订）项目计划通知（桂质监函2016324 号）附件的编写任务通知，将牛支原体肺炎防控技术规程广西地方标准的编制任务落实到广西壮族自治区兽医研究所。接到任务后，广西壮族自治区兽医研究所结合近几年的科研情况和人员情况，成立了以潘艳为组长，李 军、杨 威、陈泽祥、彭 昊、陶 立、冯世文、马春霞等同志为成员的标准编制课题组，负责标准的起草工作。二、目的意义牛支原体肺炎是一种全世界广泛存在的重要牛传染病,可引起肉牛肺炎、奶牛乳腺炎、犊牛关节炎和肺炎、角膜结膜炎、耳炎。在美国，该病每年造成的损失达 1.40 亿美元；在欧洲每年约 25%33%的牛肺炎性疫病是牛支原体肺炎，每年损失大约 1.44 亿1.92 亿欧元。2008 年，我国部分地区从国内其他地区引进的肉牛暴发了以坏死性肺炎为主要特征的疫情,最后证实为牛支原体肺炎。该病在我国主要发生于肉牛运输之后，呈现“运输应激综合征”。近几年由于我国养牛业向规模化方向快速发展，牛只引进和调运频繁；加之内陆省份犊牛培育成本高昂，造成育肥牛牛源紧张，使得我国肉牛养殖呈现“北繁南育”和“北牛南调”的独特现象。因此，该病给我国的肉牛养殖业造成了严重损失。近年来在自治区政府的大力推动下，我区养牛业得到迅猛发展。但是随着饲养规模的扩大，引种的频繁，牛支原体肺炎也频频爆发。本课题组自 2010 年开展牛支原体肺炎课题研究以来，已取得大量一手材料。据本课题组调查，我区南宁、百色、桂林、来宾、贵港等地从山东、吉林等养牛大省引进的犊牛到达目的地后，大部分牛只出现咳嗽、流黄绿色浓性鼻涕、体温升高至 41.3等症状 ，且抗生素治疗无效，发病率 40-80%，病死率高达 70-80%，给养殖户带来巨大的经济损失。以上病例最后经本实验室诊断均由牛支原体引起。目前该病已经严重制约了我区养牛业的发展。2013 年，本课题组从桂林发病牛身上首次分离出广西牛支原体病原，现今已经分离到 12株牛支原体肺炎菌株，建立了广西牛支原体肺炎菌株库，为进一步研究该病奠定了坚实的基础。筛选出一株牛支原体肺炎菌株制备疫苗，在某牛场试用取得了良好的防治效果。同时指导养牛场进行牛支原体肺炎的综合防控，大大降低了该病的发病率和死亡率，取得了显著的防控效果。本课题组起草的地方标准牛支原体的检测 多重聚合酶链反应法已获 2015 年广西壮族自治区质量技术监督局立项；申请发明专利 2 项， 支原体培养基及其制备方法已经获得授权（专利号：ZL201310715390.6） ， 一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用已经受理，进入实质审查阶段。在此基础上，为了更好地预防、控制和扑灭牛支原体肺炎疫情，本项目拟制定一套牛支原体肺炎防控技术规程，在我区推广应用，为保障我区养牛业的健康发展做出贡献。三、国内外标准对比情况国家标准GB/T14926.8-2001动物实验 支原体检测方法和地方标准DB42/T 1024-2014牛支原体肺炎诊断技术规程采用支原体分离培养方法，对实验动物的支原体进行检测，对实验设备、试剂和操作人员要求较高；本课题组建立的牛支原体的检测 多重聚合酶链反应法具有更为简便、快速、便捷的优点，可以在临床上进行推广应用。另外，目前国内外均无有关牛支原体肺炎防控技术规程方面的标准颁布。本课题组应用本标准指导我区养牛场进行牛支原体肺炎的综合防控，大大降低了该病的发病率和死亡率，取得了显著的防控效果，在我区推广本标准将具有重要的现实意义。本标准结合国内外研究成果，进行充分规范和创新，更具有先进性。四、编制过程为了确保制定的标准具有科学性、先进性、实用性和可操作性，标准编制课题组根据工作方案和任务要求进行了分工，分成二个小组，其中一个小组负责做生产实践的调查研究，深入到广西南宁、百色、桂林、来宾、贵港等地的牛场进行实地调查研究，了解目前广西各地对于牛支原体肺炎疫病防控情况，并查阅相关的技术档案和规章制定，收集第一手资料；另一个小组负责查阅国内外有牛支原体肺炎防控方面的标准、技术资料和研究报告。最后课题组将两个小组收集的材料进行汇总和整理，开始起草标准征求意见稿，并于 2016 年 10 月完成了标准征求意见稿的起草工作。五、关键技术指标依据和来源本标准的关键技术指标依据和来源是参考有关文献资料，结合我区具体情况，通过实验室研究试验及临床验证后提出。广西壮族自治区兽医研究所自 2008 年开展国家公益性行业（农业）专项“边境地区动物疫病预防控制技术体系研究”项目研究以及广西基本业务费“牛呼吸道疾病综合征病原学调查及快速检测方法的建立”等项目以来，在支原体培养基和检测方法研发方面取得了较好的研究成果，其关键技术指标依据和来源如下：1、发明了支原体培养基及其制备方法 。目前支原体分离培养常用培养基 Hartleys、PPLO、Hayflick ， 或其他改良的培养基，它们都是以牛心汤为基础配制而成的，此类培养基成本高，培养时间长、效率低，不利于支原体的大量培养，制约了疫苗生产。因此，研究和探求一种材料易得、价格低廉的支原体培养基变得十分迫切。本项目发明了一种支原体培养基，包括基础培养液，基础培养液主要由猪肺消化汤、1%水解乳蛋白胨 Earle 液和 25%新鲜酵母浸出液组成。试验证明，用猪肺消化汤取代牛心汤制作支原体培养基进行支原体培养增殖快、浓度高、效果切确，还可使支原体培养时动物血清的用量降低 50%左右，这使人工大规模培养支原体成为可能。本发明原料猪肺脏市场量大、材料易得、价格低廉，因此，应用本发明可大幅降低动物支原体培养成本。已获国家发明专利（专利号：ZL201310715390.6） 。2、发明了一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用 。对牛支原体的准确、快速检测，有利于养殖场对牛支原体病做出正确的处理措施，以及有利于日常的防治。牛支原体的病原检测，病原分离是牛支原体确诊的“金标准”，但其分离鉴定难度大、灵敏度低、耗时、需要复杂的设备及培养条件。聚合酶链式反应（PCR）法等虽然特导性和敏感性都较高，但却需要昂贵的 PCR 仪、电泳槽等精密仪器，不适用于基层开展。为解决上述问题，本发明提供一种为基层简便、快捷准确地检测牛支原体的方法，公开一种快速、实时定量的检测牛支原体环介导等温扩增试剂盒。本发明的实质性特点和显著的进步是：特异性强、灵敏度高、迅速获得结果、不造成污染、可实时定量。该专利申请已经受理，进入实质审查阶段（申请号：201510095946.5） 。3、起草了地方标准牛支原体的检测 多重聚合酶链反应法 。牛支原体肺炎检测技术主要是传统的病原分离和生化特性鉴定。病原分离培养的条件苛刻，费时、费力、分离的成功率低。生化特性鉴定又不容易将牛支原体与无乳支原体进行区分。运用基于分子生物学技术的多重聚合酶链反应方法同时鉴定这两种支原体，是一种最为简便、快捷的方法，本规程旨在推广一种能快速检测牛支原体的多重聚合酶链反应方法，检测结果在半天内获得，其在我区的推广应用，为流行病学调查和临床诊断提供技术支持。为保障我区绿色养牛产业发展做出