肿瘤免疫及其免疫检测.doc

第二十九章肿瘤免疫及其免疫检测本章考点：1.概念2.概述3.机体的抗肿瘤免疫效应机制4.肿瘤抗原的分类5.肿瘤标记物的检测及临床意义 6.常用肿瘤标志物检测的免疫学方法7.肿瘤标志物的联合检测8.肿瘤标志物免疫测定的意义9.肿瘤患者免疫状态的检测及临床意义 第一节概念 肿瘤：正常组织细胞异常增生所形成的赘生物。肿瘤免疫学是研究机体的免疫状态与肿瘤发生、发展的相互关系和免疫学方法在肿瘤诊治中应用的一门学科。其研究内容包括：肿瘤的抗原性、肿瘤的免疫逃避机制、机体抗肿瘤的免疫效应机制、肿瘤的免疫检验、肿瘤的免疫治疗等。肿瘤免疫学检验是通过免疫学方法检测肿瘤特异牲或肿瘤相关性标志物，达到早期筛选、辅助诊断、疗效考核、病情监测和预后判断等目的。肿瘤抗原的免疫检测和宿主免疫功能状态的评估，均属肿瘤免疫检验的范畴。 第二节概述 一、肿瘤发生的因素肿瘤的发生机制尚不十分清楚。内在的遗传因素、免疫状态和外部的诱变因子，是构成肿瘤发生发展的基础和条件。1.内在因素：机体的免疫状态，尤其是细胞免疫功能的强弱，已被视为是否发生肿瘤的重要内在因素。2.外部条件：化学因素、物理因素以及病毒感染等可以使细胞内原本存在的原癌基因活化、抑癌基因失活以及基因重排或突变，最终导致基因表达异常而发生肿瘤。二、肿瘤的免疫逃避机制（1）肿瘤细胞缺乏有效的抗原表位，难以触发足够的抗肿瘤免疫效应。（2）肿瘤细胞MHC分子发生改变，影响抗原递呈。（3）不能正常表达B7等活化免疫细胞的共刺激分子和粘附分子。（4）患者血清中存在着封闭因子，阻止CTL与肿瘤细胞的结合，从而抑制对肿瘤细胞的特异性杀伤。（5）肿瘤细胞产生某些免疫抑制因子。（6）细胞表达FasL，介导CTL凋亡。 第三节机体的抗肿瘤免疫效应机制 一、体液免疫效应抗肿瘤体液免疫机制是通过抗肿瘤细胞的抗体与肿瘤细胞表面特异抗原结合后，再通过以下几种途径发挥生物效应：（1）激活补体系统溶解肿瘤细胞。（2）抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）直接杀伤IgG包裹的肿瘤细胞。（3）调理吞噬作用。（4）干扰肿瘤细胞的某些生物学行为。（5）其他作用。二、细胞免疫效应细胞免疫是抗肿瘤免疫的重要机制，参与抗肿瘤免疫的细胞主要有：T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）等。1.T细胞T细胞应答是控制肿瘤生长发育的最重要的宿主应答。参与抗肿瘤免疫的两类T细胞亚群：（1）CD8+细胞毒性T细胞（CTL），受MHC-I类抗原限制。（2）CD4+辅助性T细胞（TH），受MHC-类抗原限制。（3）CD8+CTL杀伤肿瘤细胞的机制：通过其抗原受体识别肿瘤细胞上的特异性抗原，并在Th细胞的辅助下活化后直接杀伤肿瘤细胞；活化的CTL可分泌淋巴因子如干扰素、淋巴毒素等间接地杀伤肿瘤细胞。CD4+T杀伤肿瘤细胞的机制：产生淋巴因子增强CTL的功能，激活巨噬细胞或其他APC，产生肿瘤坏死因子发挥溶瘤作用。2.NK细胞（1）具有广谱杀伤肿瘤细胞的作用。（2）无肿瘤特异性和MHC限制性。（3）直接杀伤肿瘤细胞。（4）通过ADCC作用杀伤IgG包裹的肿瘤细胞。（5）NK细胞杀伤肿瘤的能力可被细胞因子所增强，包括干扰素，肿瘤坏死因子和白细胞介素-2。（6）是一类在肿瘤早期起作用的效应细胞，是机体抗肿瘤的第一道防线。LAK细胞：外周血淋巴细胞在IL-2存在下，经45天培养后，诱导出的一种新的杀伤细胞，具有广谱杀伤肿瘤细胞的作用。3.巨噬细胞（1）作为抗原提呈细胞；（2）杀伤肿瘤效应细胞；（3）巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的机制；（4）活化的巨噬细胞与肿瘤细胞结合后，通过释放溶解细胞酶直接杀伤肿瘤细胞；（5）处理和呈递肿瘤抗原，激活T细胞以产生特异性抗肿瘤细胞免疫应答；（6）巨噬细胞表面上有Fc受体，可通过特异性抗体介导ADCC效应杀伤肿瘤细胞；（7）活化的巨噬细胞可分泌肿瘤坏死因子（TNF）等细胞毒性因子间接杀伤肿瘤细胞。4.树突状细胞：是一类专职抗原提呈细胞，其极强的抗原提呈作用，辅助T、B细胞参与特异性杀伤肿瘤的过程。 第四节肿瘤抗原的分类 肿瘤抗原是指细胞癌变过程中所表达的新生物或过量表达产物。根据肿瘤抗原特异性分为：肿瘤特异性抗原（TSA）和肿瘤相关抗原（TAA）。一、肿瘤特异性抗原肿瘤特异性抗原（TSA）是指该类抗原系肿瘤细胞所特有，只表达于肿瘤细胞，而不存在于任何处于不同发育阶段的正常细胞。（一）化学物质诱发的TSA特点：特异性高；抗原性较弱；常表现出明显的个体独特性。（二）病毒诱发的TSA具有较强的抗原性；瘤细胞表面的TSA多系病毒基因的表达产物；同一种病毒诱发的不同类型肿瘤可表达相同的抗原；正常细胞无此类抗原的存在；病毒感染细胞可有此类抗原的存在。（三）自发肿瘤的抗原性自发性肿瘤是指一些无明确诱发因素的肿瘤，大多数人类肿瘤属于这一类。二、肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原（TAA）是指非肿瘤细胞所特有的抗原成分，也少量的存在于正常细胞，但在肿瘤发生的机体可异常表达。（一）胚胎抗原胚胎抗原是在胚胎发育阶段由胚胎组织产生的正常成分，在胚胎后期减少，出生后逐渐消失，或仅存留极微量。当细胞恶性变时，此类抗原可重新合成。最常见的两种胚胎抗原：甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）。（二）分化抗原分化抗原是特定组织正常分化到一定阶段所特有的标志不能刺激抗肿瘤的免疫应答；可作为肿瘤起源的诊断性标志。（三）其他TAA例如：免疫抑制酸性蛋白、组织多肽抗原、铁蛋白、唾液酸等，在某些肿瘤患者也可升高，可作为相应肿瘤的诊断指标。 第五节常见肿瘤的免疫诊断及应用原则 肿瘤诊断的三大支柱：1.影像学：B超、CT、核磁共振、同位素扫描、普通影像学诊断。2.显微诊断:细胞、组织病理诊断。3.生化免疫诊断：肿瘤的免疫诊断，乃指测定肿瘤标记物、宿主对肿瘤抗原的免疫应答和肿瘤患者免疫功能状态。目前对肿瘤标志物尚无公认的统一分类和命名标准。按照Butch分类法，可将肿瘤标志物分为以下七类，即肿瘤胚胎抗原（如AFP、CEA），肿瘤相关抗原（如CA125、CA15-3、CA19-9、PSA、SCC等），酶类（如神经元特异性烯醇化酶NSE、前列腺酸性磷酸酶PAP等），激素（hCG等），类固醇激素受体（如雌激素和孕酮受体等），单克隆免疫球蛋白和癌基因表达蛋白。一、肿瘤标志物的检测及临床意义肿瘤标记物通常指细胞癌变过程中所产生的正常细胞缺乏或含量极微的特异性和相对特异性的物质，也有可能是宿主细胞针对癌细胞所产生的正常细胞成分，但在量和质上与正常状态或良性疾病时明显不同。存在于肿瘤细胞表面、血液或体液中，如肿瘤的TSTA、TAA、TSA、激素、酶（同功酶）等。1.应用（1）早期诊断和发现肿瘤。（2）提示肿瘤发生的部位和组织来源。（3）肿瘤的鉴别诊断。（4）肿瘤治疗的疗效观察和预后判断。（5）监测肿瘤复发。2.要达到上述应用，须具有以下条件（1）肿瘤标志物的特异性强。（2）肿瘤标志物的诊断灵敏度高。（3）肿瘤标志物的产量或血清浓度应与肿瘤组织大小呈正相关。肿瘤标志物主要是用于疾病的筛查，而不具有确切的诊断意义。一般来说筛查试验主要用于高危人群，比如，患肝细胞癌的高危人群是指有慢性病毒性肝炎，特别是乙肝和丙肝的患者；前列腺癌的高危人群主要是指60岁以上的老年男性；有肿瘤家族史的健康人也应属于高危人群。 （一）临床常规检测的肿瘤标志物1.AFP性质：AFP是胚胎时期的重要血清成分，由卵黄囊和肝细胞合成，胎儿出生后，其浓度急剧下降，几个月至一年可降至正常水平，正常值小于20gL。检测方法：ELISA、RIA、荧光偏振免疫测定、免疫发光技术、自动化免疫分析等。参考值：正常值400gL时，对原发性肝细胞癌有较大的诊断价值。临床意义：成人血清AFP：（1）原发性肝细胞癌：有辅助诊断，早期诊断，鉴别诊断的意义，动态观察，AFP不高者不能排除原发性肝癌。（2）生殖系统胚胎瘤：恶性畸胎瘤。（3）消化道癌有部分。（4）消化道肿瘤肝转移。（5）妊娠，急、慢性肝炎，肝硬化有一过性AFP。2.CEA性质：胎儿肠和结肠癌病人提取肿瘤相关抗原，是一种糖蛋白。检测方法：ELISA、RIA、荧光偏振免疫测定、免疫发光技术、自动化免疫分析等。参考值：正常情况下，血清CEA4gL作为前列腺癌的诊断标准。总PSA（tPSA），游离PSA（fPSA）升高，tPSAfPSA降低，高度提示前列腺癌的可能。tPSAfPSA更有诊断价值。4.糖链抗原（CA）CAl25：CAl25是上皮性卵巢癌和子宫内膜癌的标志物，浆液性子宫内膜样癌、未分化卵巢癌患者的CAl25含量可明显升高。当卵巢癌复发时，在临床确诊前几个月便可呈现CAl25增高，尤其卵巢癌转移患者的血清CAl25更明显高于正常参考值（35gL）。CAl25测定和盆腔检查结合可提高试验的特异性。观察血清CAl25浓度有助于卵巢癌的预后评价和治疗控制，经治疗后，CAl25含量可明显下降，若不能恢复至正常范围，应考虑有残存肿瘤的可能。也见于早期妊娠，子宫内膜病。CAl9-9：正常人10%，则说明受者体内已存在细胞毒性抗体，应另选供者；若小于10%，表明供受者相配。2.还可进一步作T、B细胞淋巴细胞毒性交叉配型。T细胞交叉配型阳性视为移植的禁忌证。B细胞交叉配型对于弱类抗体更敏感。3.流式细胞法交叉配型，供者淋巴细胞与受者血清反应，与荧光标记的抗人IgG或其F（ab）2共育，用流式细胞仪检测。4.混合淋巴细胞培养：供受者淋巴细胞单或双向MLC，检测HLA类抗原相容性。5.自身交叉配型：受者血清和受者细胞进行细胞毒试验，若阳性可致与供者的交叉配型出现假阳性。纵上所述，交叉配型阳性表明受者预存抗供体的抗体。作受体选择时：组织配型差，交叉配型阴性，仍可移植。组织配型好，交叉配型阳性，不宜移植。交叉配型常用于肾移植,而不用于心、肝、肺等。二、移植物与受体的预处理（略）（一）移植物的预处理不同组织器官的移植，其移植物的处理不尽相同。例如：1.心、肺:先后应用前列腺素El、Collins和Papworth液及硫酸镁经主动脉或肺动脉灌洗待移植器官，并以空气充肺成半膨胀状态，于4生理盐水中可保存46小时。目的是清除残留的血液及细胞成分，防止过客细胞导致的GVHR。2.小肠：用巨噬细胞和树突状细胞单克隆抗体，对移植小肠进行预处理或放射线照射，抑制肠系膜淋巴结免疫细胞的功能，可改善移植物的存活状态，有效延长移植物的存活时间。3.对移植细胞的处理：大多采用体外补体依赖的细胞毒试验，即选择针对过客细胞的单克隆抗体，在补体的存在下，特异性的清除过客细胞。（二）受体的准备除了配型外，受者需要接受大剂量的免疫抑制剂或放疗，以有效的提高器官移植的成功率。三、免疫抑制措施排斥反应是移植成功的最大障碍。移植术后，人工调节受者机体的免疫状态是控制排斥反应发生的主要途径。目前采取的措施：使用免疫抑制剂。诱导受者对移植抗原的特异性耐受。（一）免疫抑制剂的应用常用者如下：1.化学性免疫抑制剂（1）环孢素A，其作用是抑制T细胞活化过程中IL-2基因的转录，从而阻断IL-2依赖性的T细胞分化增殖。（2）糖皮质激素：诱导活化的T细胞的凋亡，抑制PC表面HLA的表达，从而干扰其抗原提呈作用。（3）硫唑嘌呤：影响DNA合成，干扰T细胞的增殖。（4）环磷酰胺：抑制B细胞和T细胞免疫。2.生物性免疫抑制剂（1）细胞性多克隆抗体：与相应的细胞特异性结合，破坏相应细胞。（2）细胞性单克隆抗体：针对单一细胞发挥作用。（3）细胞因子的单克隆抗体：阻断细胞因子参与排斥反应。（4）某些融合蛋白：杀伤过客细胞的CD45单抗与蓖麻毒素的融合蛋白；杀伤IL-2阳性T细胞的IL-2与白喉毒素的融合蛋白等。（5）反义寡核苷酸：阻断CK、粘附因子和细胞分化抗原的表达。3.某些中草药：如雷公藤，对细胞和体液免疫均有抑制。（二）免疫耐受的诱导诱导受体对移植物的免疫耐受，是最理想的排斥反应防治措施。目前限于研究阶段，尚未应用于临床。研究思路：1.应用大剂量天然可溶性或人工合成的供者HLA分子，通过封闭同种抗原特异性T细胞的TCR，以诱导受者特异性T细胞凋亡。2.输注可溶性CTLA-4，阻断被移植组织细胞的B7与受者T细胞表面CD28的结合，干扰共刺激信号的形成。3.阻断CD40-CD40L、CD2-LFA3等膜分子的相互作用，使T细胞功能障碍。4.借助基因工程技术制备基因修饰的树突状细胞，介导特异性耐受。5.T细胞疫苗，诱导抗独特型抗体的产生，破坏移植物特异性T细胞。第四节排斥反应的免疫检验 排斥反应发生时，受者体内的免疫应答将发生一系列变化，检测机体免疫状态可诊断或推测排斥反应的发生。一、体液免疫水平检测相关免疫指标包括：AB0血型、其他血型和HLA抗体，以及抗供者组织细胞抗体、血管内皮细胞抗体、冷凝集素抗体等。测定方法可以根据相应抗原的特性，采取各种交叉配型、补体依赖的细胞毒性试验等。二、细胞免疫水平检测包括参与细胞免疫的有关细胞数量、功能和细胞因子水平的检测。1.外周血T细胞及其亚类的计数:测定T细胞总数、CD4+亚群、CD8+亚群及CD4+TCD8+T比值。在急性移植排斥反应临床症状出现前15天，CD4+TCD8+T、细胞比值可升高至1.2以上，而此比值小于1.08时则怀疑有感染的可能。2.4小时T细胞转化试验是检测受者致敏T细胞的一种方法。该法取外周血单个核细胞，不经培养直接加入3H-TdR，置C02培养箱温育4小时，是一项预报急性排斥反应危象较为满意的试验。3.NK细胞活性测定:大量免疫抑制剂的应用，造成受者机体NK细胞活性的抑制，但在急性排斥反应时明显升高。4.细胞因子的测定:IL-1、IL-2、IL4、IL-6、IFN-7和slL-2R等的检测，已作为监测移植排斥反应的常用项目。这些细胞因子的水平均可升高。应用免疫标记法检测受者血清中细胞因子时只能对接受移植物前后的变化进行对比分析，仅作参考。血清肌酐值和IL-2R若同时增高，则对急性移植排斥反应的发生有诊断意义。骨髓移植中发生的GVHR是移植排斥反应的特殊类型。临床实验室可采用有限稀释分析法，计数供者外周血单个核细胞中分泌IL-2的特异性T细胞比值。此比值110万，判断为有发生GVHR的可能；若小于此比值，则提示不发生GVHR。该法为单向MLC，但又不同于一般的MLC。供者外周血单个核细胞经有限稀释法稀释成单个细胞，然后在体外两次接受受者细胞的刺激，即供者外周血稀释后与20Gy放射性照射的受体外周血单个核细胞混合培养l4小时，洗去上清液后再加入40Gy放射性照射的经EB病毒转化的宿主B细胞（该细胞本身并不产生IL-2，但对供者T细胞具有更强的刺激和诱生IL-2之作用），经24小时培养后，取上清液测IL-2活性。5.粘附分子及其配体的检测:粘附分子及其配体的表达与急性排斥反应的发生密切相关。诸如ELAM-1、VCAM、ICAM和HLA分子等。三、补体水平的检测在移植物遭受排斥时，补体成分的消耗增加，含量减少。血清总补体和单个补体成分活性或补体的裂解产物，如C3a、C3b、C3d等的测定，对于了解补体的活性很有帮助。检测方法有：免疫电泳、免疫标记技术等。检测凝血系统、纤溶系统、激肽系统活性，也有助于补体活性水平的判断。四、急性时相反应物质的检测C反应蛋白（CRP）、IL-1、IL-6、TNF-以及HSP等炎症分子，在发生感染和自身免疫性疾病时均有不同程度的增高。同种异基因干细胞移植时CRP升高，移植后发生细菌或真菌感染时CRP增高更为显著。在肝、肾移植中，CRP的动态测定结果与器官移植后并发症的发生相关，且比白细胞计数或发烧更敏感。CRP的测定尚未作常规项目，但外科创伤、急性排斥反应的发生以及感染等的关系，正被认可。第五节常见的组织或器官移植 临床器官移植术的创建至今已有50多年的历史，从肾移植到心肺移植、肝脏移植；从完整的器官移植到部分组织器官甚至是细胞移植；从单一的器官移植到器官联合移植。经历了理论、伦理、技术等考验，逐步走向成熟并越来越多地被人们所接受，成为临床治疗不可逆器官的终末期衰竭性疾病的唯一手段。一、肾脏移植肾脏移植，始创于l950年，开展最早、应用最多和效果最佳的一种器官移植。肾脏移植已成为临床器官移植的重要项目。肾脏移植患者l年和5年的存活率分别可达90%95%和80%90%。在HLA基因背景与供者相同或接近的患者，移植存活率甚至高达十数年或数十年。（一）组织配型在肾脏移植中的应用组织配型是肾脏移植前选择供者的重要手段，主要包括AB0血型配型、HLA配型和交叉配型。在供者器官选择时，应该遵循以下原则：以AB0血型完全相同者为好，至少能够相容。选择最佳HLA配型的供者器官。由于HLA抗原系统复杂，不可能完全匹配，“可允许的不相容匹配法则”法则规定：必须相配的位点包括10个类和5个类HLA位点，其余的位点均为“可允许的不相容配型位点”。在器官移植中，实际上只力求最佳匹配。由HLA-C等位基因表达者少可不必重视，而HLA-D、DR与移植排斥反应关系密切，应匹配。在器官缺乏的情况下，对受者施用免疫抑制剂，不再强调HLA配型，但AB0血型应该相容，预存的细胞毒抗体必须阴性。（二）肾移植受者的疗效监测肾移植中超急排、急排和慢排均可出现。因免疫抑制剂的应用，导致病毒等细胞内寄生的微生物感染，可影响移植物的存活和受者的健康。肾移植的疗效监测，主要依赖于受者免疫状态的检测。临床观测的项目包括：T细胞总数、CD4CD8比值和IL-2及其受体的检测。以帮助判断排斥反应的发生，评估免疫抑制剂治疗的效果；组织活检观察肾组织炎症细胞的浸润或CsA中毒情况，以预测排斥反应的发生和调整用药剂量；根据条件，选用RIA或HPLC法动态测定CsA血药浓度，以指导合理用药，减少肾毒性。二、骨髓与其他来源的干细胞移植（一）骨髓移植骨髓移植是移植中独具特性的移植类型，可同时存在HVGR和GVHR。此类移植主要被应用于白血病、淋巴瘤以及再生障碍性贫血等遗传性血液系统疾病的治疗。目前全世界接受自体或异基因个体骨髓移植者已分别达到数万人。HVGR和GVHR均发生于异基因移植者，而在自体骨髓移植者，因无HLA差异不产生移植排斥反应，成功率可达l00%。为了提高骨髓移植的成功率，仍应进行涉及供体选择的HLA配型、红细胞血型鉴定等。对配型不理想者，可通过适当减少供体骨髓中的T细胞以达到减轻GVHR之目的。常用方法有CD3单抗结合去除法等。骨髓移植，实质上是造血干细胞移植。骨髓中造血干细胞的质和量对移植的成败至关重要。造血干细胞的测定可选用FCM法、细胞培养、免疫标记分析及细胞因子（CSF、IL-3等）刺激的方法。造血干细胞的特征性表面标记是CD34，其中多能干细胞为：CD34 +CD38-、CD34+HLA-DR-等。定向干细胞为：CD34+CD38+、CD34+HLA-DR+等。在骨髓中CD34+细胞约占单个核细胞的1%4%，外周血的CD34+细胞仅为0.01%0.1%。当受到肾上腺皮质激素、抗肿瘤药及某些重组细胞因子等作用后，外周血CD34+细胞可大幅增高，此为干细胞移植提供了另一条可能的途径。（二）