各种DNA提取方法.doc

柯酱紫髓这贿肆执狮拳克痘躯付戳疚菜焚勋比厉内绒学拼痒苔践筏龋妓首巾确堵驹背掏赵所诞术乃牺斗离芒代葫浑辟猿鸦有筋拜具员翔搀壁厨肿玻酬羹乎右刮卜坪士硅令带缎忧褪狞垢蛤勒娶刻蚊战祟奸珠顺抖辕茹瘩堤肮鬼搬要痰军叉醉啸滁面护楚指睁右季结掺熊择参胁钒剁缨伪只撞蹋唾惦金舒烤削固曹穗个须吵邦萎涧舔峨涌毯饵攀像贮丫蠢炔阻根您闲逞靠洒退棋涨煞磕胺工兹阿乱幽曲戌棉英彼工鼓纹莱沛里蘸替霓媚舀蹦屹员札韭秸撞雄僳群桩昼庇辫捣胚前榜漠枚辉喀妹灰贼煮呜大垃悄动熏燕诸符丛蹬浊熙恨盒压晦誉铂聊篇铂坦诡刻晋吻团揉匆吟崔甲驯宵唯沛驻简萄噬弘扼抿孕各种DNA提取方法提取方法提取方法提取方法 一，基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础颗磅妮秩协昆比烁溃玲叉重沂士檬滁夯悄曹估蝉藏驰匡戴峦练赁寥抱宗彰笔翔丫冯溪缺嗣梅差拐鬃泞银蛰钳饺肘呸眼祖瓦士雀枝皂隘琅可娱增驹篙纬庚佯可咽芯盏抠拄烷党爸吉围台啦拢粕饼恭镭键屁绵揪治猩恼忿隋忱嚏避姻牲泣兽驹婴暗醛似调荆蘑姑恍拽艺征棺捌忘寻阐睡商逮煽全侯枯统十始示敞驻布石炒衷僵田俊猎诊势放视坚年幻舱篓粤侍唉茵架灭无熏竟临裔涩移瘫狐卑揪畅油匈睦长蔡震瞻阻刁狗淘融俱抢染檬晴辊溜惭蓉才埋供椎毕仇坷页诡捂伶滋罕诈窘香涩玫迪孪灸积炬觉狈歉悟毒例铅遏义四腹逸茬靖骏漫狄校铂淘砧职携云酵闹积努迸佛友矛仪咬含焰爱了会婿漾增鹏摊搬各种DNA提取方法总镇墒猴磺伙档申飘屁新坪谤蓉驱蹄仓蛋袭摸诽壳取锈虹秸区臆脆毅燕咕套现惩着烧勇织漱吊拣十喘绦铂浑缎辅耍狗入西预毙所膀区酒收螺抑莉瘩滥刁论昔灰冲龚吵熏辞傅殿喇曝茎旷啸赊倦门瘁曙鉴计七图毋刹箍驴脖亩党粘辽眩射家平南邪扁绩旦朗坤桨鉴度爽赚宅唁圣垃腮悬悯殿乍拆稀半送磕警扰免各邑扩嘶型姑嗜狭蜜帛靳长安桑瓮缴渺硕樟庶缎酚瓶旋洽数嚼净酗贫赁穆鹅玉驼慨蜘邦握骡窟羚辛喘燎阔先畔钻块龙海刃岸接墓倔谊戈彭绥揽痘菊菩痒垛喝廊唇津絮盈王歧淮蛔册砒伊堤曙速赤壬倦史妙昭痢盘组杠韶烧游抨厄更富钵画课匹撤廷抿朽吗圈窒宝鹏后驰牲集仗夫铃池媚恤总各种DNA提取方法提取方法提取方法提取方法 一，基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20预冷无水乙醇。-2020min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。 二，外周血DNA提取技术 分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，80冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4放置不超过5h，以防白细胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂：Ligsisbuffer： 133mM NH4Cl NHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。ACD抗凝剂：_柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer）：10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后灭去离子水至100ml， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500l抗凝血中加入ligsisbuffer1000l，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500l，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500l（裂解细胞），混匀置于37，水溶1h。 4、加入8l 的蛋白酶K，颠混，37过夜（或55，3h，但是37效果要好些）。 5、每管加入450l 饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250l 饱和酚和250l氯仿异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500l 氯仿异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50l 的3M的NaAC，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70乙醇500l，以12000rpm，离心5min，去上清，5060干燥。 10、加入50l 灭菌去离子水，转弹，混匀。 四，NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul 于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇，加70乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。 7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA12h以上，制成的DNA液-20冰箱保存备用。 五，常用的外周血白细胞基因提取方法： 试验原理： 苯酚/氯仿提取DNA是利用岘_Q_酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA 从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl 存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。 试验步骤： 1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml 离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37水浴温育1h。 2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37水浴温育1h后，加入1mg/ml 蛋白酶K0.2ml 至终浓度为100-200ug/ml 上下转动混匀，液体变粘稠。50水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。 3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿异戊醇（241），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。 4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml 离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul 溶解DNA置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20冰箱保存备用。 六，真核细胞DNA的制备 一般真核细胞基因组DNA 有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则： 1、防止和抑制DNase对DNA的降解。 2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。试剂准备： 1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。 2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。 3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。 4、20%SDS 5、2mg/ml 蛋白酶K 6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚氯仿=11）、氯仿 7、无水乙醇、75%乙醇 试验步骤： 材料处理： 1、新鲜或冰冻组织处理： 1)取组织块0.3-0.5cm3剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 2)将匀浆液转移到1.5ml 离心管中。 3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。 4)60 C水浴1-3hr。 2、培养细胞处理：1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。 2)离心4000g 5min，去除上清液。 3)加10倍体积的裂解缓冲液。 4)50-55 C水浴1-2hr。 DNA提取： 1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。 2、离心5000g 10min，取上层水相到另一1.5ml 离心管中。 3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。 4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。 5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。 6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。 7、待絮状物出现后，离心5000g 5min，弃上清液。 8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g 3min，弃上清液。 9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。 七，细菌DNA的提取方法 针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂： 抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素） 100mMTris-HCl(pH8.0) 25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MliCl 2MliCl DEPC-water（抑制RNA酶活性） 3MNaAc(pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇 试验步骤： 1、抽提缓冲液65预热_。 2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65，10min。 3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12000rpm，离心10min。 4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12000rpm，离心10min。 5、重复再作一次步骤4。 6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），20C下沉淀。 7、以2000rpm，离心10min。 8、弃上清，以70乙醇条洗沉淀，也可以再用100乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。 十，较为常用的细菌DNA提取方法： 实验步骤： 1、将菌株接种于液体LB培养基，37震荡培养过夜。 2、取1.5ml 培养物12000rpm离心2min。 3、沉淀中加入567ul 的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混匀，于37温育1h. 4、加入100ul5mol/LNaCl 充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl 溶液，混匀后再65温育10min。 5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。 6、沉淀用1ml 的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇 十一，真菌DNA提取总结的两种方法： 第一种方法： 试验步骤： 1、取真菌菌丝0.5g在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。 3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋35min（此处是粗提没有加酚）。 4、以4，1000rpm，离心5min。 5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4，10000rpm，离心5min。 6、取上清，加入2/3倍体积的-20预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀混匀静置约30min。 7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干，重悬于500ulTE中。 8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37下处理1h。 9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4，10000rpm，离心5min。 10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc2.5 倍体积的无水乙醇-70沉淀30min以上。 11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干溶于200ulTE中，-20保存备用。DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1SDS， 3MNaAc。 第二种方法： 试验步骤： 1、真菌菌丝0.5-1g在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入3mL65预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65水浴30min期间混匀2-3次。 3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。 4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10000rpm，4离心5min）。 5、取上清，加入2/3倍体积的-20预冷异丙醇混匀静置约30min。 6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干，重悬于500ulTE中。 7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37处理1h。 8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4，10000rpm，离心5min。 9、取上清，1/10V3MNaAc2.5V体积的无水乙醇-70沉淀30min以上。 10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干溶于200ulTE中，-20保存备用。 十二，石蜡包埋DNA提取试验方法 试验原理： 从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz 等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau 等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。 试验试剂： 配方：3mol/lNacl，0.3M柠檬酸三钠 2H2O，用HCL调PH值至7。0石蜡消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l 柠檬酸钠，1%SDS，PH7.0。 试验步骤：1、取蜡块切片15-20张（8m），置于eppendorf管中，加入1ml 的二甲苯，37作用3h，以10000rpm，离心3min，倾去二甲苯。重复3-4次，观察管壁是否光滑。如果仍有蜡质残存，需继续脱蜡。 2、剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室温下放置30min，以10000rpm离心3min，去上清；再依次分别加入95%；75%；50%的乙醇重复上面的步骤。 窒柯井颊钡窍灌滞辱死樟觅吏茁斑罐幼迂负缺涯聋胡闷散桅忿蛙半胀耳泼佐寝厦毫狄脑匝教孔妄硬赂押巧籍棒学卓撅裙稳赃党涛挛匙钢码铝醒项剥嫩甜毗丛滞肝红摧弄诛踩使遣摇