银杏果多糖抗氧化活的初步研究.doc

银杏果多糖抗氧化活性的初步研究1 材料与仪器1.1材料银杏果，收集于沈阳农业大学校园内（10月份采摘）; NBT( 氯化硝基四氮唑蓝)，上海恒星应用化学研究所；核黄素，北京奥博星生物技术责任有限公司；1，1-二苯- 2-苦肼基( 1，1- diphenyl- 2-picrylhydrazyl， DPPH， 纯度 95%) ，A Johnson MattheyCompany; 其他所用试剂均为国产分析纯。1.2仪器数字恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；低速离心机，北京医用离心机厂; 循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；SL- 202 型电子天平，上海长桥精密科学仪器有限公司超净工作台，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；日光灯反应箱，自制。2方法银杏果多糖的提取银杏果去核，过 40目筛80%乙醇回流浸提( 水浴温度 60)，过滤，滤渣风干样品称重，水提取抽滤，粗多糖提取液浓缩至原体积的1/4，醇析沉淀，冷冻干燥，多糖粗品。2. 4 银杏果多糖的含量测定多糖的含量测定：采用苯酚 硫酸法葡萄糖标准曲线: 将20 mg 葡萄糖溶解并定容至500 mL 分别量取母液 0. 5 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0mL， 定容至10 mL， 各量取1 mL 溶液、 1 mL 6%苯酚、5 mL 浓 H2 SO4 摇匀放置10 min， 沸水浴加热15 min，冷却至室温， 在490 nm 波长处测定吸光度值 以含量为横坐标， 吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。菌丝多糖含量测定: 分别量取不同体积的各种菌丝多糖母液装入具塞试管中， 配制成浓度梯度 然后再从试管中分别量取 1 mL 溶液装入小试管中，并依次加入1 mL 6%苯酚溶液， 5 mL 浓 H2 SO4， 摇匀放置10 min， 沸水浴加热 15 min，冷却至室温，在 490 nm波长处测定吸光度值， 根据标准曲线计算出不同菌丝中多糖含量。2. 5 银杏果多糖抗氧化活性的体外测定将银杏果多糖定容至25 mL，进行如下抗氧化活性的测定。2. 5. 3 清除 DPPH 活性的测定采用提取物与稳定自由基 DPPH 反应的分析方法。 在同一具塞试管中加入2 mL DPPH 溶液( 2104mol /L) ， 1 mL 不同浓度样品溶液，摇匀，室温避光静止30 min， 用无水乙醇作参比在 517 nm 处测定吸光度 A 样品 用1 mL 蒸馏水代替样液，测定空白吸光度A。 空白用2 mL无水乙醇代替 DPPH，测定吸光度值 A 对照 样品对 DPPH 的清除率计算:E /% = 1 ( A样品 A对照) /A空白1002. 5. 4 还原力的测定本研究采用铁离子还原法( FRAP) 和铁氰化钾还原法来测定各样品的还原力 具体方法: 分别取2.5 mL 不同浓度的样品于试管中， 依次加入 2. 5 mL0. 2 moL /L pH 6. 6 的磷酸盐缓冲液和2. 5 mL 1% K3 Fe( CN) 6 于50 水浴保温 20 min 后，快速冷却，再加入 2. 5 mL 10% TCA， 以 4 000 r /min 离心 10min， 取上清液2. 5 mL， 依次加入2. 5 mL 重蒸水， 0. 5mL 0. 1%FeCl3， 充分混匀， 静止 10 min， 以蒸馏水为对照在700 nm 处测定吸光度值。抗卵黄脂质过氧化活性的测定采用依赖鸡卵黄脂蛋白的脂质过氧化模型，将新鲜卵黄用等体积的0.1molL-1 pH 7.4的PBS按1:1配成悬液，再稀释成1:25(卵黄:总体积)，磁力搅拌30min。在试管中加入上述卵黄悬液0.2mL，分别加入样品0.1mL(对照管加入PBS)，再加入25mmoLL-1的硫酸亚铁0.2mL，最后用0.1 moLL-1 PBS补至2mL。3结果与分析3. 1 清除