细菌的抹片制做及染色.doc

实验三 细菌的抹片制做及染色【目的要求】(1) 了解细菌简单染色法和革氏染色法的原理(2)掌握细菌抹片标本的制备及几种常用染色法的操作步骤【器材】(1)大肠杆菌、葡萄球菌、巴氏杆菌等1824小时液体培养物和斜面培养物。(2)美蓝染色液、革兰氏染色液和瑞特氏染色液。(3)载玻片、接种环、酒精灯、染色架、蜡笔、吸水纸等。【原理】细菌个体微小，无色而半透明，折光性弱，在普通光学显微镜下观察活细胞时，只能见其大致轮廓。必须制成抹片标本，应用适当染料染色后，才能较清楚地观察到细菌的形态及某些构造。此外，还可根据细菌呈现出的不同颜色反应而对其进行鉴别。【内容和方法】(一)细菌抹片标本的制备1.抹片 根据所用材料不同，抹片的方法亦有差异(1)固体培养物 用经酒精灯火焰烧灼灭菌后的接种环，蘸取无菌蒸馏水(无菌肉汤、生理盐水均可)一环于清洁无油脂的载玻片中央，再钩取细菌的固体接着物少许混于蒸镏水中，涂抹成直径为115cm大小的均匀菲薄的抹片。(2)液体培养物 可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液12环，涂抹于玻片上即可。但应注意净管底Iili物摇匀，以免影响涂片效果。(3)组织涂片 用灭菌的剪刀镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为肝脾组织，脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于染色和观察。2.干燥 将抹片置于空气中让其自然干燥3固定 固定的方法因材料不同而异：(1) 火焰固定 细菌培养物抹片，常采用火焰固定法，即将已干燥的抹片菌膜面向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次(用手背触及抹片反面，以不烫手为宜)。(2) 化学固定 血液、组织等抹片常用此法固定，即以数滴甲醇滴加在玻片上，固定35min。抹片经固定后便粘附于玻片上而不易被水冲掉，并能改变细菌对染料的通透性，增加与染料的亲和力而更容易着色，同时多数细菌能被杀死。(二)细菌的常用染色方法1.简单染色法 只用一种染料进行染色的方法。染色后一般只能显示出细菌的外形、大小及排列。美蓝染色法在已固定的细菌抹片上，滴加美蓝染色液染i2min，水洗，干后镜检。结果细菌呈蓝色。2、复杂染色法 用两种或两种以上的染料进行染色的方法。结果使不同的细菌或不同的构造呈现出不同颜色，从而显示出细菌的特殊结构及染色特性。(1) 瑞特氏染色法细菌抹片自然干燥后，滴加瑞特氏染液约1ml以固定标本，l-3min，再滴加与染液等量的磷酸缓冲液或中性蒸镏水，轻轻晃动玻片或用口吹气，使之与染液混匀，经3-5min，待表面显金属闪光，水洗，干后镜检。 结果细菌吁蓝色，组织细胞等物呈其他颜色。 (2)革兰氏染色法 在经固定后的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，染13min，水洗。 加革兰氏碘液媒染13min，水洗。 滴加95乙醇脱色约30秒至1分钟至水洗。 用石炭酸复红或沙黄染色液复染12min左右，水洗，干后镜检。 结果革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 革兰氏染色法是微生物学中最重要和广泛使用的一种鉴别染色法，此法能将所有的细菌分成两大类：染成蓝紫色的革兰氏阳性菌和红色的革兰氏阴性菌。其原理主要是由于两类细菌细胞壁的化学组成和结构的不同。革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖层很厚，且结构致密，当用乙醇脱色时，肽聚糖层孔径缩小，使结晶紫一一碘的复合物被截留在细胞壁内，所以细菌仍保留结晶紫的颜色。革兰氏阴性菌的细胞壁脂类含量高，乙醇抽提出脂质，导致通透性增加；且因肽聚糖含量低，结构疏松，其孔径在乙醇处理后仍保留足够的大小，致使结晶紫一一碘复合物可被洗脱出来，经复染后，则染上了复染液的红色。(三)细菌的特殊染色方法1. 抗酸染色法(石炭酸复红硫酸美蓝法) 在经固定后的抹片上滴加石炭酸复红液，微加热染3min，水洗；再用硫酸美蓝液(美蓝2g溶于75ml水中，慢慢滴加浓硫酸25ml混合即成)染约lmin，水洗，干后镜检。结果：抗酸菌呈红色，其他细菌皆为蓝色。2. 荚膜染色法(碱性美蓝染色法) 细菌抹片自然干燥后，滴加甲醇固定35min，用水轻微冲洗；再用碱性美盐染色液染23min，水洗，干后镜检。结果：荚膜呈粉红色，菌体呈蓝色。3. 芽胞染色法 在已固定的细菌抹片上，滴加石炭酸复红液，微加热至发生蒸气染5min，水洗；用95乙醇脱色2min，水洗；再用碱性美蓝液复染1rain，水洗，干后镜检。结果：芽胞呈红色，菌体呈蓝色。4. 鞭毛染色法(魏曦一张颖悟二氏改良染色法)(1) 染液配制第一液：20钾明矾液(加温溶解)2Oml，5石炭酸液50ml，20鞣酸液(加温溶解)20ml。第二液：复红酒精饱和液。取第一液9份与第二液1份混合后立即过滤。滤液放置6h后使用，其效果更佳。(2) 染色方法 取变形杆菌68h血琼脂平板培养物，仔细从菌膜伸展最远处挑菌少许，轻轻放入盛有蒸馏水的试管中，经数分钟让其自行分散后，再置37中孵育2530min。取上述菌液1接种环，轻轻滴于洁净无油迹的玻片上。涂抹时接种环随水滴移动，切勿与玻片相磨，以免鞭毛脱落。待抹片自然干燥后(勿用火焰固定)，加染液染l2min，水洗，干后镜检。结果：鞭毛呈淡红色，菌体呈红色。 附：常用染色液的配制和特殊的染色方法 通常将常用染色液配制成乙醇或水的饱和溶液以作原液贮存，以后再稀释成不同浓度。 按配制量及染料溶解度称量，放入乳钵中，先倾入少量溶剂进行研磨，待染料全部溶解后，倒入棕色瓶中，再用其余溶剂将乳钵中染料逐一洗入瓶常用染料在水和乙醇中的溶解度内避光保存 染料100溶剂中染料 的克数 染料100毫升溶剂中染料 的克数于水中f95乙醇中于水中于95乙醇中俾士麦褐Y结晶紫(氯化物)伊红Y(钠盐)碱性品红(新)孔雀绿(草酸盐) 1_36 1.68 44.20 1.13 7.60 1.08 13,87 2.18 3.20 7.52 甲基紫 美蓝(氯化钠) 中性红(氯化物) 沙黄O 甲苯胺蓝O 2.93 3.55 5.64 5.45 3.82 15.21 1.48 2.45 3.41 0.571 .碱性美蓝染色液美蓝乙醇饱和液 30ml10氢氧化钾水溶液 01ml蒸镏水 lOOml混合即成2、石炭酸复红液碱性复红乙醇饱和液 lOmll5石炭酸水溶液 9Oml混合即成3、稀释石炭酸复红液石炭酸复红液 lOml蒸镏水 90ml混合即成4、革兰氏染色液(1) 草酸铵结晶紫染液结晶紫乙醇饱和液 20ml 混合即成